基因工程原理-测序技术.pptVIP

* 测序原理 体外构建好的两端带接头的单链DNA文库； 单链DNA文库在一个油包水的乳液环境中进行PCR扩增 由于起始阶段模板浓度非常低，因此大部分包含磁珠的乳液滴都只含有一种模板； 经PCR扩增，每个磁珠只连有一种模板的扩增产物 打破为乳液滴，收集磁珠，加入芯片中； * 测序原理 经乳液PCR法扩增后携带有大量模板的磁珠被置于芯片上的微孔中； 焦磷酸法测序 每一轮反应都会掺入一个核苷酸，同时释放一个焦磷酸； 焦磷酸和腺苷酰硫酸在硫酸化酶的催化下生成ATP； 荧光素酶在ATP参与下将荧光素转化为氧化荧光素，同时发出荧光被检测器检测到。 * 工作流程 文库制备 乳液PCR 焦磷酸测序 加入含酶小微珠 芯片制备 * 工作流程 一、样品输入并片段化 基因组DNA、BAC等被打断成300－800 bp的片段； 对于小分子非编码RNA或者PCR扩增产物，直接使用 二、文库制备 将A和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DNA片段上； 接头将用于后续的纯化、扩增和测序步骤； 具有A、B接头的单链DNA片段组成了样品文库。 * 工作流程 三、一个DNA片段连接一个磁珠 单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上，每一个磁珠携带了一个独特的单链DNA片段； 磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，成为只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。 四、乳液PCR扩增 每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增，没有其他的竞争性或者污染性序列的影响； 整个片段文库的扩增平行进行； 每一个片段扩增后产生几百万个相同的拷贝； 乳液混合物被打破，扩增的片段结合在磁珠上。 * 工作流程 五、测序 携带DNA的捕获磁珠（20?m）随后放入PTP板（Pico?Titer Plate）的微孔（29 ? m）中进行后继的测序反应； 反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到，有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号； 由此一一对应，可以准确快速地确定待测模板的碱基序列 六、数据分析 454测序系统可以在10小时的运行当中获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息； 提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：达400 MB的从头拼接和任何大小基因组的重测序。 * 454 sequencing： Emulsion PCR (emPCR) Generation of millions of clonally amplified templates on each bead No cloning and colony picking Mix DNA Library capture beads (limited dilution) “Break micro-reactors” Isolate DNA containing beads Create “Water-in-oil” emulsion + PCR Reagents + Emulsion Oil Perform emulsion PCR Adapter carrying library DNA A B Micro-reactors Adapter complement Enrich Anneal Seq primer * 454 sequencing： Deposition of DNA beads into the PicoTiter?Plate Centrifuge Step Load Enzyme Beads Load beads into PicoTiter?Plate * 454测序系统图示 A为液体试剂供应装置 B为反应池 C为光线检测成像系统和计算机控制系统 * 测序质量 454测序技术的准确率在99%以上； 其主要限制来自同聚物，也就是相同碱基的连续掺入，如AAA或GGG； 由于没有终止元件来阻止单个循环的连续掺入，同聚物的长度需要从信号强度中推断出来。这个过程就可能产生误差； 454测序平台的主要错误类型是插入-缺失。 * 图a为高通量鸟枪Sanger测序法策略 图b为鸟枪循环芯片测序法策略 * 454测序仪的先行者地位 Leamon、Rothberg等人撰写的一篇介绍该技术的论文被引用了570多次 100多篇经过同行审议的关于人类遗传学、代谢组学、生态学、进化学以及古生物学的论文（peer-reviewed publications）都是使用454测序仪开展的研究 * 一个4Mb基因组和3个6Mb基因组测序 传统的Sanger测序法：需要好几个月的时间， 454测序仪，一位实验人员，包括样品制备等步骤在内所用的时间仅需要一周 使用454测序仪还避免了传统测序方法中细菌克隆阶段可能出