分子生物学导论-分子生物学的研究方法.ppt

第四节 DNA重组技术 第五节 基因分离技术 第六节 分子杂交技术 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。 分子杂交是目前分子生物学最广泛应用的技术之一。利用此技术，可以求出特定基因的频率、基因组织的特点、基因结构和定位、基因表达等。 电泳凝胶核酸印迹法 斑点和狭线印迹法 菌落和噬菌斑印迹法 E.M. Southern于1975年首先设计出来的。 材料： 尼龙滤膜 硝酸纤维素滤膜 二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE） 步骤： 第一：将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上－核酸印迹转移 第二，是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的DNA探针进行杂交 一、Southern印迹杂交(DNA) Southern Blotting的过程 1. 碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA 2. 通过电泳液的移动转移胶中的DNA 3. 固定胶中的DNA到膜上 4. 预杂交和杂交（放射性和荧光检测） 5. 结果检测 M 1 2 10×SSC转移缓冲液 Whatman滤纸 凝胶 Whatman滤纸 纸巾 玻璃板 重物 支持物 500g 1 2 与探针同源杂交的基因DNA片段 基因组DNA DNA酶切片段 内切酶 NC或尼龙膜 NC膜或尼龙膜 将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。 二、Northern印迹杂交 （RNA） 同尾酶(Isocaudamer) 能切割产生相同末端的限制性内切酶，一般是指能产生相同粘性末端的限制酶。具有不同识别序列的限制性内切酶,切割DNA分子后产生相同的粘性末端。例如：SalI与XhoI, BamHI与BglⅡ。 所有平末端酶产生的末端均是相同的，但一般不把它作为同尾酶来研究。 同裂酶(Isoschizomers ) 来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同。比如Sma1和Xma1，它们均识别CCCGGG，但前者切后产生平末端，后者切后产生粘性末端。 （一） DNA的连接 1. DNA连接酶 通过合成相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，从而修复缺口或催化粘合完全分离的两个DNA片段。eg: T4 DNA ligase T4 DNA连接酶（需要ATP作为辅助因子）主要用于： （1）连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段； （2）双链DNA分子间的平端； （3）在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或 适配子。 四、DNA的连接和转化 2. 粘性末端连接 连接后可能出现以下问题： （1）载体自身环化，造成假阳性背景克隆，为避免此问题，可在连接前，用碱性磷酸酶将载体DNA 5’- 端去磷酸化，这样只有载体和插入片段之间才能发生连接； （2）插入片段可双向插入； （3）插入片段可多拷贝插入。 3. 平端连接 平端连接的优点是可用T4连接酶连接任何DNA平端，这对不同DNA分子的连接十分有利。 平端连接的主要问题是，它的连接效率比粘性末端低，因此需较多的T4 DNA连接酶和较高的底物浓度，聚乙二醇（PEG）可促进平端连接反应。 4. 人工接头连接 5. 利用适配子连接 （二）重组DNA的转化 1. 转化（transformation） 指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。接受转化DNA的菌株称为受体菌株。 转化时，细菌必须经过适当的处理（如电击法，CaCl2，RbCl(KCl)等化学试剂），使之处于感受态 — 即容易接受外源DNA的状态，然后利用短暂热休克使DNA导入细菌宿主中。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-，M-)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。 常用的大肠杆菌菌株： DH5a JM109 TOP10 常用的农杆菌菌株： EHA105 LAB4404 （1）将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原