实验一 单菌株发酵产纤维素酶的研究.doc

实验一 单菌株发酵产纤维素酶的研究 本章利用实验室筛选的三株产纤维素酶菌株,用水稻秸秆—稻草做培养基的主要碳源,进行了单菌株发酵产酶试验,并对其中的高产菌株进行了发酵条件优化。 实验流程 实验准备(试剂配备，稻草预处理，葡萄糖标准曲线的制作)——菌种显微及菌落形态观察——发酵种子液制备——接种发酵——串珠霉、链霉菌、枝抱菌发酵初始产酶活力比较（通过测定发酵后的试液的OD值，通过查葡萄糖标准曲线确定生成还原糖的含量，计算酶活）——串珠霉发酵条件优化(单因素实验)——筛选影响产酶的重要因素(PB设计法)——重要因素的响应面分析(BB设计法)——结果分析（解释实验图与分析表）——小结 名词解释 本实验选取了三种菌，链霉菌、枝抱菌(cladosPorium)、串珠霉(Monilia)。 链霉菌是放线菌目的一科。 枝孢菌是一种能够产生分生孢子的霉菌 串珠霉 无性世代为半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丝孢科，链孢霉属(Monilia)。 CMC-Na(羧甲基纤维素钠）　　是天然纤维素经化学改性后得到的纤维素衍生物，是 纤维素的羧甲基醚化物，是盐 。用于CMC酶活力的测定。 单因素实验：实验中，只有一个因素在变化，其余的因素保持不变的试验叫做单因素试验。做单因素试验时为正交试验做准备，为正交实验提供一个合理的数据范围。本实验中，对串珠霉的优化过程中，为了得到最佳发酵条件，依次确定一个变量，其他因素保持不变。 PB设计法是SAS统计软件中的一种二水平设计法。它能通过实验设计、多元二次回归方程及对回归方程的分析,最终寻找出多因素系统中最佳条件瞬一6习。SAS中的PB设计法能用最少试验次数,从众多因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素。 BB设计 BB设计法提出的中心组合设计是常用的SAS分析方法,适用于2至5个因素 的优化实验[67l。由PB实验得出稻草、鼓皮添加量及pH值是影响纤维素酶活的主要因素,在此基础上,利用BB设计法对这三个因素进行了响应面分析。此法每个因素取3个水平,以〔1,O,l)编码,然后对数据进行二次回归拟合,得到带交互项和平方项的二次方程,分析各因素的主效应和交互效应,最后在一定的水平范围内求出最佳值。 注意事项 1 稻草为什么用碱处理？ 在热的稀硫酸作用下，样品中的糖、淀粉、果胶质和半纤维素经水解而除去，再碱处理使蛋白质溶解、脂肪皂化而除去，所得的残渣即为粗纤维。如其中含有无机物质，可经灰化后扣除。样品经热的中性洗涤剂浸煮后，残渣用热蒸馏水充分洗涤，样品中的糖、游离淀粉、蛋白质、果胶等物质被溶解除去，然后加入α-淀粉酶溶液以分解结合态淀粉，再用蒸馏水、丙酮洗涤，以除去残存的脂肪、色素等，残渣经烘于，即为不溶性膳食纤维（中性洗涤纤维）。 2 葡萄糖标准曲线的绘制 a 配置不同葡萄糖含量的溶液，为纤维素酶的活性测定提供依据。纤维二糖酶(CBH酶)活力的测定方法从纤维素酶解机制上考虑,应以纤维二糖为底物酶解后测葡萄糖生成量表征酶活力。内切型B一1一4葡聚糖酶(CMC酶)活力的测定方法以磷酸膨胀纤维素、梭甲基纤维素或轻乙基纤维素等无定形纤维素为底物,以还原糖生成量表征酶活力。俗称CMCase或Cx酶活力。 b混合液由一定浓度的葡萄糖和DNS构成，加热5分钟，葡萄糖与DNS（3-5二硝基水杨酸）反应，还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。实验中加10毫升水，在于稀释反应液，使OD数值在可测范围内。 c OD是opticaldensity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词，检测单位用OD值表示，OD=lg（1/trans），其中trans为检测物的透光值。光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。 实验二 双菌株混合发酵产纤维素酶的研究 。本章利用实验室筛选的链霉菌、枝抱菌、串珠霉三株产纤维素酶菌进行了双菌株混合发酵试验,并对产酶高的组合菌株进行了混合发酵的工艺优化研究。 在实验一的基础上， 1，进行混合优化实验，为单因素实验 .串珠霉与枝袍菌混合发酵条件优化试验 为真菌与真菌混合 （二菌混合方式对混合发酵产酶的影响，二菌株不同生长期培养液混合，二菌混合发酵时间，二菌接种比例） .串珠霉与链霉菌混合发酵条件优化试验，为真菌与放线菌混合 （二菌混合方式，温度转换时期，起始PH值，接种比例，发酵时间） 枝抱菌与链霉菌混合发酵条件优化试验， 为真菌与放线菌混合 （混合方式）