山羊乳腺特异性表达载体的构建与表达特性的研究-动物学专业论文.docxVIP

符号说明Ampicillm 符号说明 Ampicillm 氨苄青霉索 Calf intestinal alkaline phosphatase 犊牛肠碱性磷酸酶 centimeter 厘米 square centimeter 平方厘米 deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸 ctay 天 deoxy-nucleotide triphosphate 脱氧核苷三磷酸 椰一m耐一d一一h hour 小时 ethylenediamine tetracetic acid 乙二胺四乙酸 isopropyl一8一D-thiogalactoside 异丙基硫代．B．D．半乳糖苷 kilodalton 千道尔顿 kilobase 千碱基 t3一galactosidase 0．半乳糖苷酶 mole 摩尔 multiple cloning site 多克隆位点 minimum essential medium 基础培养基 minute 分钟 mililiter 毫升 nanogram 纳克 phosphate—buffered saline 磷酸盐缓冲液 polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 ribonucleic acid 核糖核酸 rotation per minute 转／分 sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠 second 秒 Tris／EDTA buffer TE缓冲液 5-bromo．4．chloro．3．indolyl 5．溴．4．氯．B-D一半乳糖糖营 ．13．．D-galactoside mmrogram 微克 microliter 微升 l圣如曲妣M删一咖m略|耋融眦哪雠。咂Ⅷ雌¨：妻 Micromole 微摩尔 陈刚：山羊乳腺特异性表达载体的构建与表达特性的研究山羊乳腺特异性表达载体的构建与表达特性的研究 陈刚：山羊乳腺特异性表达载体的构建与表达特性的研究 山羊乳腺特异性表达载体的构建与表达特性的研究 硕士研究生：陈刚 导 师：孙怀昌教授 摘 要 为了构建具有自主知识产权的山羊乳腺特异性表达载体，利用高保真聚合酶 链式反应(PcR)从中国奶山羊基因组中扩增出6个B一乳球蛋白(BLG)基因片段和 1个B一酪蛋白(13．casein)基因片段。序列测定结果证明，所获基因片段的D N A 序列与已发表的山羊及绵羊相应基因区域具有很高的同源性，5一端凋控区中主要 的乳腺特异表达调控元件完全相同，不仅说明此两个基因在山羊、奶山羊和绵羊 之间是高度保守的，而且说明所用的DNA聚合酶具有很高的保真性，所扩增的基 因片段可用于乳腺特异表达载体的构建。将上述基因片段进行组合，构建成一系 列乳腺特异性表达载体。将lacZ报告基因分别克隆入自行构建的p205C3载体和 从困，b31进的pCX及pHC载体，将所获得的重组载体分别用脂质体介导法转染奶 山羊乳腺上皮细胞系，经泌乳激素诱导后用X—gal进行酶组化染色，结果表明自行 构建的载体驱动报告基因的表达水平高于从国外引进的、已知具有高表达性能的 载体。上述重组载体在COS一1细胞和山羊皮肤成纤维细胞不能表达相应的报告 基因，表明其具有较好的组织特异性。根据上述实验结果可以得出结论，本研究 构建的乳腺特异性表达载体能用于动物乳腺生物反应器的研制。 关键词：中国奶山羊；13．乳球蛋白基因；13一酪蛋白基因；PCR扩增；序列分析； 乳腺特异表达载体构建；乳腺上皮细胞表达 扬州大学硕士学位论文-2Construction 扬州大学硕士学位论文-2 Construction of Goat Mammary Gland—Specific Expression Vectors M．S Candidate：Gang Chen Supervisor：Prof．Huaiehang Sun Abstract To construct mammary gland—specific expression vectors，6 13-lactoglobulin(BLG) gene fragments and 1 p-casem gene fragment of expected sizes were amplified from Chinese dairy goat genomic DNA using high fidelity long template PCR system．Partial sequence analyses showed that all 7 gene fragments were more than 99％identical to that of goat and sheep，especially the key regulat