AG490对大鼠创伤性脑损伤急性期小胶质细胞激活的影响.docVIP

PAGE PAGE 1 AG490对大鼠创伤性脑损伤急性期小胶质细胞激活的影响 　　小胶质细胞是中枢神经系统的免疫防御系统的主要介质［1］，是创伤性脑损伤后炎症反应不可缺少的部分［2-3］。在各种创伤、感染等病理状态下，小胶质细胞被激活，释放促炎细胞因子如白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导炎症反应［4］。CDllb是实验研究中鉴定小胶质细胞的主要表面抗原物质［5］，静息状态下的小胶质细胞表面抗原CDllb极少表达，活化后其表达明显升高。AG490是一种人工合成的苯亚甲基丙二腈的脂类衍生物，是JAK激酶/信号转导和转录激活因子（januskinase/signaltransducerandactivatoroftranscription，JAK/STAT）信号通路的抑制剂，目前尚未应用于临床［6］。近年来关于AG90的研究范围已涉及生物学的诸多方面，包括抗肿瘤研究、免疫反应机制研究等［7-10］，但其在创伤性脑损伤中的作用研究相对较少。本研究就AG90对创伤性脑损伤急性期小胶质细胞激活的影响进行探讨。 　　1材料与方法 　　1.1实验动物 　　健康成年雄性SD大鼠120只（体质量250～300g），购于河北省实验动物中心，于安静、温暖、避强光的环境中饲养。随机数字表法分为对照组（n=40）、TBI组（n=40）、TBI+AG490组（n=40），每组再分为6、12、24、72h四个亚组，每个亚组各10只动物。所有大鼠用10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉后，剪去头部毛发并固定，常规消毒铺巾，正中矢状位切开头部皮肤，剥离颅骨外膜，在左侧距离矢状缝、冠状缝各5mm处用牙科钻钻直径4mm的骨窗，保持硬脑膜完整，骨蜡止血。对照组仅行开窗，不予以创伤。TBI组及TBI+AG490组采用液压冲击法致伤动物，于伤后1h进行NSS评分［11］，以确保各组有相似损伤程度。TBI+AG490组大鼠于伤后1h腹腔注射AG4905mg/kg，对照组和TBI组大鼠给予等渗盐水腹腔注射5ml/kg。于规定时间处死动物，各亚组随机取5只动物，切取伤灶周围脑组织用于CD11b检测及组织病理学检查；5只用于干湿质量法检测脑组织含水量。 　　1.2主要试剂及仪器 　　PE-ANTI-RATCD11b（美国BioLegend公司），AG490（美国ALEXISBIOMOL公司），流式细胞仪（美国BeckmanCoulter公司），Olympuscx21光学显微镜（日本Olympus公司），LeicaRM2125轮转石蜡切片机（德国Leica公司）。 　　1.3小胶质细胞表面抗原CD11b表达测定 　　按以下步骤处理：取脑组织约1g于平皿中，加入PBS缓冲液，将平皿置于冰水混合物中，仔细剥除脑组织表面的脑膜及血管，用眼科剪将组织剪至匀浆状，用20ml注射器吸取组织匀浆，用100目细胞筛过滤到试管内，再经300目细胞筛过滤掉细胞团块，制备成单细胞悬液；1000r/min离心5min；弃上清液，用振荡器使细胞分散，用100μlPBS缓冲液重悬；每个样品收集2×106细胞；1000r/min离心5min；加一抗10μl，4℃孵育30min，1000r/min离心5min；去上清液，加PBS缓冲液定容至500μl；上机检测。上述过程均同时设有阴性对照（不加入任何抗体）。 　　1.4脑含水量测定实验 　　处死大鼠后开颅经大脑中线切开，去掉嗅叶与小脑，滤纸吸掉脑组织表面水分，电子分析天平称量伤侧脑组织湿质量。称湿质量后，于 　　70℃恒温干燥箱中36h烘干至恒重，称量获得干质量。根据Ellit公式计算脑含水量：脑水含量（%）=（湿质量-干质量）/湿质量×100 　　1.5组织病理学实验 　　取脑组织于4%多聚甲醛溶液中固定24h，再经脱水、透明、包埋，在石蜡切片机上进行5μm连续切片，展片后用载玻片捞取切片烤干，然后按照以下步骤进行：石蜡切片常规脱蜡入水；自来水冲洗5min；苏木精染色10min；自来水冲洗1min；1%盐酸酒精分化30s；自来水冲洗1min；伊红染色30s；自来水冲洗1min；常规脱水；透明、封片；光学显微镜观察。 　　1.6统计学方法 　　采用SPSS13.0软件包分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多样本均数比较采用单因素方差分析（ANOVA）统计，组间比较采用LSD-t检验。以P 　　2结果 　　2.1流式细胞术检测CD11b表达 　　TBI组脑组织CD11b表达在伤后6h即开始升高，在12h达（30.7±1.39）%，72h仍处于较高水平，与对照组相比明显升高，差异具有统计学意义（P 　　2.2脑含水量测定 　　TBI组脑组织含水量在伤后6h即开始升高，在24h达（89.46±9.56）%