辣根过氧化物酶的生物印迹及其催化低聚苯胺的合成-细胞生物学专业论文.docxVIP

西北师范大学辣根过氧化物酶的生物印迹及其催化低聚苯胺的合成高亚娟 西北师范大学 辣根过氧化物酶的生物印迹及其催化低聚苯胺的合成 高亚娟 PAGE PAGE 7 摘 要 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase）是一种从辣根中提取的过氧化物酶（E， C,），分子量为 44000D 的糖蛋白，含糖量为 18%。它的分子包含一个亚铁 血红素辅基，其卟啉环是原卟啉，中心离子是 Fe(Ⅱ)。由于原料易得，商品价格低 廉，作用底物广泛，成为过氧化物酶中使用最广泛的酶之一。在有机合成中作为催 化剂使用，其催化机理为过氧化循环过程，对苯胺及其衍生物，酚类等有很高的催 化效率。在酶免疫测定中，由于 HRP 具有发光底物，因此而建立的化学发光免疫 测定在临床中得到广泛应用。近年来，HRP 在有机合成、生物传感器、食品分析、 生物医学检测、荧光分析、污水处理等方面的应用更为突出。尤其在免疫诊断试剂 术、生物传感器、木素降解和工业“三废”处理等方面的应用研究进展飞速。 本课题以辣根过氧化物酶为研究对象，以对苯二胺和过氧化氢为底物，在25% 的二氧六环溶液中，从酸碱性、温度、底物浓度等几个方面，初步研究了辣根过氧 化物酶催化氧化反应的一般特性，测定了部分酶促反应动力学参数，同时对反应产 物进行表征。结果发现HRP热稳定性较差，酸碱适应范围较窄，有机相催化效率低， 且酶易失活等不良特性。因此，本文以提高有机相酶催化效率、水相酶热稳定性为 出发点，结合分子印迹和生物印迹两种技术达到对辣根过氧化物酶的印迹。利用底 物对苯二胺诱导酶构象，获得天然印迹酶（NIP），并加入酰化试剂马来酸酐制备乙 酰化印迹酶（DIP），冷冻干燥后加入交联剂和引发剂进行紫外光聚合，聚合完毕 后用二氧六环洗脱配体，最后干燥就得到了所需的交联印迹酶聚合物（CLIPs）， 即为水相生物印迹酶。 为了考察三种酶（天然印迹酶、乙酰化印迹酶、交联印迹酶聚合物）的性质， 研究内容设计如下： （1）考察印迹酶在有机相中的催化活性，并分别考察pH值、温度、水含量、表观 Km四因素对印迹酶催化活性的影响。同时与有机相游离酶进行比较； （2）考察乙酰化印迹酶在水相中的催化活性，并分别考察pH值、温度、表观Km三 因素对乙酰化印迹酶在水相中的催化活性的影响，同时与水相游离酶进行比较； （3）考察交联印迹酶聚合物在水相中的催化活性，并分别考察pH值、温度、表观 Km三因素对交联印迹酶聚合物在水相中的催化活性的影响，同时与水相游离酶进 行比较。结果表明，三种酶酸碱稳定范围及最适pH保持不变；印迹后酶活性提高约 10倍，表观Km值减小约30倍；交联后酶热稳定性显著提高，80℃时酶活性仍然很 高。但催化效率仍然很低。 由此可见，生物印迹技术在改良酶特性、提高有机相酶促反应催化效率等方面 是行之有效的。但交联印迹酶聚合物催化效率仍然很低，可望从以下几个方面提高 未来生物印迹酶催化效率：印迹模板的选择要恰当；最大可能地减小印迹微粒的粒 径，以得到可溶的催化剂；酶催化机理研究有待进一步深入。 关键词 辣根过氧化物酶 对苯二胺 生物印迹 Abstract The horseradish peroxidase (horseradish peroxidase) is (E , C ) one kind of peroxidase drawed in horseradish, whose molecular weight is 44000 D glycoprotein and sugar content is 18%.Its molecule contains Heme prosthetic group, whose porphyrin link is original porphyrin and the centre ion is Fe (II). Since material is available and its price is cheap and the substrate is broad, then it is becoming one of the broadest enzyme. Useed in organic synthesis as catalysator, whose catalyzes mechanism is peroxidation circulation, it has very high catalysis efficiency on aniline and their derivative.the kind waits for phenol to. Since HRP has the glowing substrate, among enzyme i