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HTRF 产品纵览 HTRF 的优势 HTRF 是不需要洗涤的ELISA。其优势如下：  操作非常简单  体系非常稳定  反映样品的实际情况，假阳性假阴性率低，可去除由于天热产物自发荧光引起的背景 HTRF 原理 HTRF 技术基于时间分辨荧光（TRF ）和荧光共振能量转移 （FRET）两大技术原理 时间分辨荧光 （TRF ） TRF 利用稀土元素中镧系元素的独特性 质。它们与普通荧光的主要区别是荧光的持续时间不同。普通荧光 的半衰期为纳秒级，镧系元素的半衰期是毫秒级，有6 个数量级的 图1：时间分辨荧光技术原理 差别。所以，在检测时，TRF 有一个时间延迟50 微秒。经过这 个时间延迟，普通荧光的信号几乎为零。所以，TRF 的背景非常低， 反映样品的实际情况。 荧光共振能量转移（FRET）FRET 技术利用了两种荧光基团的能 量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体 （Donor）和能量受体 Donor 与Acceptor 距离较远， 无FRET （Acceptor ）。Donor 被外来光源激发（例如氙灯或激光），如果 它与Acceptor 比较接近，可以将能量共振转移到Acceptor 上，使 其受到激发，发出特定波长的发射光。 将Donor 和Acceptor 分别与相互作用的两个生物分子结合，生物 分子的结合可以将Donor 和Acceptor 拉到足够近的距离，产生能 量转移。由于Acceptor 的发射光来自于能量转移，所以在实验中 不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。 HTRF 的能量供体 HTRF 的能量供体是铕（Eu）和铽（Tb ）的穴状化合物。在这个 Donor 与Acceptor 距离 较近，产生FRET 穴状化合物里，Eu 和Tb 被永久地嵌合在一个笼子里，结构非常稳 定。这个结构是由J.M. Lehn’s 教授发明的，并由此在1987 年获 得了诺贝尔奖。 1 图2 ：荧光共振能量转移技术原理 HTRF 的能量受体 HTRF 的能量受体也有两种，XL665 和d2 。它们的光学性质相同，分子 量不同。前者分子量为105 KD，实际上就是别藻蓝蛋白（APC ）。我们 将APC 的亚基偶联在一起，使其不能解离，提高了稳定性。后者分子量 为1 KD，在某些实验中有独特的优势。 HTRF 的操作步骤 HTRF 的操作步骤非常简单，只需要将实验所需试剂加进去，然后孵 图3：穴状化合物的结构 育、检测即可，如图4 所示。 HTRF 的数据分析 HTRF 采用了比值法来处理数据，可以去除由于溶液通透率、细胞大小、 细胞数量不同引起的误差。如图5 所示，由于溶液通透率不同导致的读 数不同，如果不用比值法，则会得出错误的结论。 图4 ：HTRF 的操作步骤 图5：HTRF 比值法数据分析可去除样品干扰 HTRF 的应用范围 G 蛋白偶联受体研究：受体第二信使检测 受体配体结合 胞内信号分子检测 激酶活性检测：胞外激酶活性检测 胞内激酶活性检测 生物标志物检测：基于抗体的夹心法和竞争法检测 抗体检测：抗体重链含量测定、抗体轻链含量测定 生物过程分析：GST 含量测定、HIS 含量测定、CHO 宿主蛋白含量测定 免疫过程分析：CD16 结合检测、CD32 结合检测、CD64 结合检测 相互作用分析：蛋白-蛋白、蛋白-多肽、蛋白-DNA、蛋白-RNA 蛋白修饰：蛋白甲基化、蛋白乙酰化、蛋白泛素化、蛋白水解