Lecture第十一部分基因芯片(DNAMicroarrays).pptVIP

核酸与核酸反应 核酸的组成：由许多单核苷酸组成的多聚物，核苷酸是由碱基、戊糖和磷酸构成； DNA二级结构、变性与复性：当温度升高，稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程；当温度回复正常值时，变性核酸的互补链重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。 核酸分子杂交：应用核酸分子的变性和复性的性质，根据两条核酸单链在一定条件下可按碱基互补原则退火形成双链的原理，用已知的单链核苷酸片段作为探针检测样本中是否存在与其互补的同源核酸序列的方法 ;回顾;回顾;生物传感器;内容提要;芯片分析的实质是在面积不大的基片（玻璃片、硅片、尼龙膜等材料）表面上有序地点阵排列了一系列固定于一定位置的可寻址的识别分子 ，反应结果用同位素、荧光法、化学发光法等显示，然后用精密的扫描仪或CCD摄像技术记录，通过计算机分析，综合成可读的IC总信息。;芯片分析实际上也是传感分析的组合，芯片点阵中的每一个单元微点都是一个传感探头。传感技术发展的精髓往往都被应用于生物芯片的发展。 阵列检测可以大大提高检测的效率，减少工作量，增加可比性。 ;芯片的分类：根据用途还可以把生物芯片分为两类：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）;基因芯片分类：根据探针的类型和长度，基因芯片可分为两类。 其中一类是较长的DNA探针（100mer）芯片，这类芯片的探针往往是PCR的产物，通过点样方法将探针固定在芯片上，主要用于RNA的表达分析。 另一类是短的寡核苷酸探针芯片，其探针长度为25 mer左右，一般通过在片（原位）合成方法得到，这类芯片既可用于RNA的表达监控，也可以用于核酸序列分析。 ;基因芯片：是通过微阵列技术, 将高密度DNA片段阵列通过机器或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。 ;工作原理：与经典的核酸分子杂交方法是一致的，都是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测??行定性与定量分析，能够在同一时间内平行分析大量的基因，进行大信息量的筛选与检测分析。 微阵列技术巨大优势在于它可以并行地宏量获取生物信息，借助此技术发展的生物芯片则提供了以核酸杂交为基础的基因水平的表达监控，多态性研究和基因分型(genotyping)，从而使我们对基因表达调控有更深入的了解。;基因芯片的优点 高度并行性：提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读，在短短的几十分钟至数小时内，就可以完成用传统方法需要数月才能完成的几万乃至几十万次杂交分析试验。 多样性：可进行样品的多方面分析，提高精确性，减少误差。 微型化：减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速率。 自动化：降低成本，保证质量。 基因芯片的缺点 在同一温度下杂交，不同探针杂交效率不同;芯片测定过程基本步骤;11.1基本概念;载体：用于连接、吸附或包埋各种生物分子使其以水不溶性状态行使功能的固相材料统称为载体 载体表面必须有可以进行化学反应的活性基团，以便与生物分子进行偶联 单位载体上结合的生物分子达到最佳容量 载体应当是惰性的和有足够的稳定性，包括机械的、物理的和化学稳定性 惰性：载体不干扰生物分子功能 稳定性：在压力或酸、碱条件下而不发生变化 载体具有良好的生物相容性 通常要有良好的光学性质，能适应投射或反射光的测量;适用于制作生物芯片的载体材料较少，通常使用玻璃片、金属片和有机高分子膜等 来源方便，表面羟基容易活化，然后能偶联DNA、酶、抗体、蛋白质、多肽等 大多数生物芯片采用发光检测的方法，不管投射光还是反射光都适合;载体活化：通过化学反应用各种不同的活化试剂在载体表面键合上活性基团，以便与配基共价结合，形成具有不同的生物特异性的亲和载体，用来固定生物活性分子。;探针的设计：如何选择芯片上的探针 确定芯片所要检测的目标对象 查询生物分子数据库——取得相应的DNA序列数据 序列对比分析——找出特征序列，作为芯片设计的参照序列。 数据库搜索——得到关于序列突变的信息及其它信息。 cDNA芯片设计的关键在于数据库的建立和数据库信息的利用以及各种文库的建立;在进行探针设计和布局时必须考虑：互补性、敏感性和特异性、容错性、可靠性、可控性、可读性 对于DNA序列变异分析，最基本的要求是能够检测出发生变异的位置，进一步的要求是能够发现发生了什么样的变化。从杂交的单碱基错配辨别能力来看，当错配出现在探针中心时，辨别能力强，而当错配出现在探针两端时，辨别能力非常弱。所以，在设计检测DNA序列变异的探针时，检测变化点应该对应于探针的中心，以得到最大的分辨率。 ;11.3基因芯片的探针;光刻DNA合成法：由Affy