第二课 转基因动物.ppt

2．嵌合体的表型 嵌合体的性别比率 雄性ES细胞能产生较高比例的雄性嵌合体，易于快速培育以验证突变基因经生殖系的传递。雌性来源的XX细胞系被认为是不稳定的。 X连锁的突变和杂合效应 在含有X连锁基因突变的雄性ES细胞中，因为嵌合体小鼠是突变等位基因的杂合子，表现为何种表型与携带突变的细胞数量和类型以及相对于嵌合体组织的比率有关。 三、培养纯合基因 整合于单位点的外源基因稳定传代的可能性较大，而整合于不同染色体多个位点上的外源基因稳定传代的可能性较小。 外源基因在整合入小鼠基因组时，有可能受到某些酶的剪切、甲基化等修饰，修饰后的基因在传代过程中丢失的可能性较大。 转基因动物技术使动物和人体基因工程研究从以往的单基因离体水平的操作，发展到了离体和在体相配合的、分子和细胞水平操作的，有动物整体水平产生效应的崭新阶段，它使得人们能从更完整的系统中去认识生物分子的作用，应用前景广阔。 转基因动物研究的意义和作用： 1、生命现象的基础研究。转基因动物是对多种生命现象本质深入了解的工具，如研究基因的结构与功能的关系，细胞发育的潜能性、细胞核与细胞质的相互关系、胚胎发育调控、肿瘤、神经与发育等。 2、可以用来建立多种动物模型，进而研究这些疾病的发病机理、治疗方法及新药的筛选。 3、可作为医用或食用蛋白的生物反应器。通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白，一直是转基因动物研究的热点。现在已有数十种人体蛋白在家畜乳腺中表达，这些蛋白可以用于治疗人类相关疾病。 4、利用基因敲除技术提供廉价的异种移植器官。只要将引起强烈免疫排斥反应的异源分子基因敲除掉就可以。例如培育不含免疫排斥的转基因克隆猪。 5、改良和培育动物新品种。如使生长速度加快，瘦肉率提高、肉质改善、饲料利用率提高、抗病力增强等 6、基因治疗。人类第一例于1990年对SCID综合症的小孩实施体细胞基因治疗获得成功。 转基因动物的饲养管理 １、避免混淆。在转移小鼠笼时，务必将鼠笼标记信息和笼内小鼠一起转移。 ２、转入病毒全基因组的动物，病毒可能在体内复制，可能与接种病毒的小鼠有类似的逸散、传播方式和感染途径。 3、逃逸。造成遗传污染，改变自然界的生态平衡、改变生物的多样性和破坏生态环境。 防逃逸设施至关重要 小鼠标记方法 在小鼠2－3周龄时，就可以将幼鼠分笼。由于母鼠孕期为21天左右，所以为了避免下一窝幼鼠的出生，前一窝幼鼠一般要在3周龄以前分笼。 将小鼠按雄性和雌性分笼，一个笼子一般不超过5只小鼠。 分好笼后，对小鼠按下面图示做标志，并记录好母系、父系和代数。做标记的同时，对每只小鼠剪2－3 mm的尾巴用于做基因鉴定。 一、基因敲除的技术路线 基因打靶的结局有如下可能： (1)靶基因被灭活，即基因敲除，当打靶载体中插入一个特定的DNA序列就可以实现基因敲除（Knockout）。 (2)靶基因被导入的外源基因替代，可以是以正常基因替代突变的基因。 (3)在受体细胞基因组中定点引入一个原本不存在的完全新的基因，称之为基因击入(gene knockin)。 基因打靶的方法 进行基因打靶要经历以下步骤： 构建打靶载体、 打靶载体导入受体细胞(常用胚胎干细胞，即ES细胞)、 打靶ES细胞导入囊胚、 囊胚植入假孕母鼠子宫发育 二、ES细胞 ①ES细胞在合适的体外培养条件下，可使细胞保持分化的全能性。 ②已建立了非常完善的筛选体系，很容易获得同源重组的细胞群体。 三、打靶载体的构建 基因打靶的关键在于构建打靶载体。在打靶载体中需要一个与靶基因同源的DNA片段，这一片段称为同源重组指导序列(homologous recombination directing sequences, HRDS)。 外源基因插入这一同源序列之中。HRDS一般用基因组DNA而不用cDNA，因cDNA容易造成缺失或其它改变，长度可从3kb至15kb。 依据打靶载体插入受体细胞基因组的方式不同，打靶载体可分为两种类型 O型载体，亦称插入型载体 这种打靶载体在与靶基因发生同源重组时将全部插入到靶基因特定位点中，插入型载体一般用于基因击入(gene knockin)和基因敲除(gene knockout)。 Ω型载体，亦称替代型载体 这种打靶载体在与靶基因同源重组时HRDS之间外源基因将取代受体细胞基因组与HRDS同源序列之间的基因。因此，除可用于基因击入、基因敲除外，还可用于基因修正(gene repairment） 3、选择性标记基因 Neo基因： 编码新霉素磷酸转移酶，可以使G418（阻碍蛋白合成的氨基糖苷抗生素）失活。 Hpr