三代测序技术发展及其他-公开课件.pptVIP

三代测序技术发展及它 ---LXF 2013.4.10 1 第一代测序技术 原理： 1.Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977) 2.MaxamGilbert DNA化学降解法(Maxam Gilbert,1977) 2 Dideoxynucleotides（双脱氧核苷酸） ddNTPs 是反应终止剂 可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。 反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs(一般3-4：1)。 3 Sanger双脱氧终止法 与 PCR反应类似； 反应体系中包含：模板 DNA,Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测序引物； 反应过程： 变性－复性－延伸－终止 4 Sanger第一步：加入复制终止剂 5 ddNTPs参与下的DNA复制 Sanger法测序产物的平均 链长取决于ddNTP：dNTP的比例,比例高时，得到较短的产物； （BigDye， HiDi） “标记／终止法”测序产物 的平均长度可通过标记反应中dNTP浓度(高浓度能得到长的产物)或终止反应的ddNTP:dNTP来调整。 6 Sanger第二步：荧光检测 7 Gel ElectrophoresisDNA Fragment Size Determination DNA 带负电 DNA在电泳胶中的迁移率 与其片段大小有关 8 关于ABI3730xl 毛细管规格: 96道毛细管 毛细管长度: 50cm 凝胶的规格: POP-7液体分离胶 配套的试剂: 基因测序(BigDye3.1v和5×Sequence buffer) 基因分型(Liz120, Liz500, ROX500) 基因测序及分型的运行时间 时间：96样本 ~2h 通量：（94-96）/384*12 读长：700-900bp 9 长片段的测序 Primer Walking：获得未知克隆的序列信息，或者验证克隆序列的准确性。如果提供参考序列，可以一次完成长片段克隆的全长测序。  Fragment1 Fragment2 Fragment3 Fragment4 Legend： Primer Fragment 10 基于ABI3730xl平台的扩展应用 1. Gene Synthesis： protein/DNA sequence of interest design oligos order oligos Run 1st round PCR (assembly) Run 2nd round PCR (amplification) ligate into vector, transform Pick colony and screen recombinants by colony PCR Sequencing recombinants Plasmid minipreparation ~4 day between PCR amplification and sequencing-confirmed plasmid (at best!!) 11 基于ABI3730xl平台的扩展应用 2. STR: STR/SSR: 是由长度为2-7个碱基的核苷酸序列重复构成的多态性DNA标记，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度可变性，因此在同一个基因位点创造了多个不同的等位基因。微卫星分析通常被用来创建遗传图谱，连锁分析以及对遗传性状的追踪。 原理：在一端引物上标记特定的荧光,通过PCR产物长度大小，检测基因型. 12 基于ABI3730xl平台的扩展应用 2. STR: 13 基于ABI3730xl平台的扩展应用 3. SNP: 传统测序法 金标准 14 基于ABI3730xl平台的扩展应用 3. SNP: 传统测序法 金标准 15 基于ABI3730xl平台的扩展应用 3. SNP: SNaPshot 适合5-12个及以上的SNP位点的检测 该检测方法的主要原理为单碱基延伸技术，并且利用引物片段的大小，从而把不同位点的检测结果区分开。 16 基于ABI3730xl平台的扩展应用 17 基于ABI3730xl平台的扩展应用 18 基于ABI3730xl平台的扩展应用 19 基于ABI3730xl平台的扩展应用 3. SNP: SNPlex SNPlex Genotyping System是基于荧光检测方法来进行。 DNA模板直接与一套3个探针组成的系统结合，这3个探针包括2个等位基因探针ASO和1个位点特异探针LSO。当ASO探针和LSO探针与模板完全匹配时，连接酶连接两条探针。然后使用