微生物可行性报告完整版.docxVIP

重组 HSV- Ⅱ新型溶瘤病毒疫苗可行性报告 学 院 ： 生物工程学院 专业班级： 生工 1501 班 学生姓名： 吕永斌 指导教师： 裘娟萍 摘要：经过重组减毒的Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒在体外具有良好的溶瘤效果， 经过 研究，目前已经能建立以 Vero 细胞为基质的重组 HSV 一Ⅱ病毒疫苗反应器微载 体无血清悬浮培养生产工艺， 最大病毒滴度可达到 6.62 lgTCID50 ／ml 以上。为 Vero 细胞为基质的无血清病毒疫苗规模化培养提供了一种简便、高效的工艺方法，可计划用于工业化生产。 关键词：重组 HSV- Ⅱ；Vero 细胞；生物反应器；微载体培养 正文： 1. 产品的意义：目前恶性肿瘤已超过心脑血管类疾病成为首位人类致死性疾病  ,  采用 Vero  细胞培养技术生产的重组溶瘤性Ⅱ型单纯疱疹病毒  (HSV-  Ⅱ ) 具有良好的溶源性、靶 向性和安全性 , 具有重要的应用价值。 国内人类肿瘤疫苗的有关研究处于刚起步状态， 面临多重难题，建立高效的肿瘤疫苗生产工艺具有非常重要的社会和经济价值。经过重 组减毒的Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒作为高效新型病毒疫苗有望用于肿瘤的临床研究。 1.溶瘤病毒的作用机制 生产材料： 细胞培养： Vero 细胞 ② 病毒株：重组Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒 HSV — II ，中国医学科学院肿瘤研究所提供。 ③ 微载体： Cytodex 1 ④ 生物反应器 图 2.产品外观图 3. Cytodex 1 微载体 4.Vero 细胞图 5.生物反应器 经济效益： 经查阅 ATCC ， Vero 细胞为免费（不包邮） ；病毒株需向中国医学科学院肿瘤研究所申请提供（几乎免费） ；微载体 Cytodex 1 市价为 3 元 /瓶；生物反应器可租借。 成本保守估计（不算设备使用费） ：每支成本约为 6 元，预售价为 98 元，除去设备费和 人工生产费，约可净得利润 30RMB/ 支（ 1ml ）。 生产工艺流程： 图 6.生产车间流程图 在反应罐培养间中进行重组 HSV —Ⅱ病毒疫苗的微载体悬浮培养，步骤如下： ① Cytodex 1 微载体制备： 称取一定量 Cytodex l 置于二甲基二氯硅烷硅化的转瓶／瓶 子内，加入 PBS(pH 7 ． 2) 水化，比例约为 80～ 150 mL ／ g Cytodex 1 ，约 3h 后将 PBS 倾去，加入新 PBS 继续水化约 3 h( 可过夜 )，倾去并用新的 PBS 洗涤一次。 高 压灭菌 121℃ ，30min ，冷却后倾去 PBS ，用培养基洗涤一次后倾去，重新加入新 鲜培养基置 4℃ 冰箱平衡过夜，待用。 PBS 继续水化约 3 h( 可过夜 )，倾去并用新 的 PBS 洗涤一次。高压灭菌 121℃ ， 30 min ，冷却后倾去 PBS ，用培养基洗涤一 次后倾去，重新加入新鲜培养基置 4~C 冰箱平衡过夜，待用。 Vero 细胞的生物反应器培养： Cytodex 1 浓度为 3 g ／L ，接种密度 2O ～ 30 cells ／ MC ，转速 45 r／ min ，温度 37~C ，溶解氧浓度 (DO) 通过 Air ， O 和 N：的进气比 控制在 40％空气饱和度， pH 通过调节 CO 的进气量和 7 ．5％ (w ／ v)NaHCO 控制 在 7． 15 ～ 7 ． 2，进行 1． 5 L ／ 5L 反应器培养。 ③ Vero 细胞的微载体球转球转移培养： Vero 细胞于转瓶／反应器内微载体上培养 2 ～ 4d，待长成单层时，向培养基中加入一定体积的新微载体，与长满细胞的老微载体 按照一定比例混合，进行间歇／连续搅拌培养，待细胞转移贴附成功后，进行常规 连续搅拌培养。 ④ Vero 细胞的微载体在位消化转移培养： Vero 细胞于转瓶／反应器内微载体上培养 2 ～ 4d，待细胞长成单层，即处于指数生长期时，进行在位消化转移培养。首先停 止搅拌，待微载体沉降完全后将培养基排出， 用 37~C 温浴的 PBS 以约 150 ml PBS ／g MC 的体积洗涤两次。 向微载体内加入 37~C 温浴的胰蛋白酶 (含 0 ．02％ (W ／ V)EDTA 50 ml ／ g MC) 缓慢搅拌约 2 min 后倾去胰酶液，静止待细胞变圆后，以一 定的比例加入含新微载体的培养基，并以一定转速快速搅拌约 2 min 后，补足培养 基并以 35～ 40 r ／ min 的初始搅拌转速连续搅拌培养。 约培养 12 h 待细胞在微载体 上完全贴附后，将微载体悬液放大到下一级生物反应器内进行培养。 ⑤ 重组 HSV- Ⅱ病毒的反应器培养： Vero 细胞于反应器内微载体上培养 2～ 4d ，待细