SSB-DNA聚合酶III界面结构和该结构在DNA复制中起的作用.docxVIP

Structure of the SSB–DNA polymerase III interfaceand its role in DNA replication SSB-DNA聚合酶III接口结构和该结构在DNA复制中的作用 The EMBO Journal (2011) 30, 4236–4247 IF=9.205 研究背景及问题的提出 大肠杆菌的DNA复制起始于oriC位点，在该位点形成两个分开的复制叉，多种蛋白质组成复制叉形成复制体。在复制复合体内，基因组DNA打开形成单链DNA模版，DNA聚合酶III进行DNA合成。由于DNA是反向平行的双螺旋结构，所以DNA复制时半保留复制，前导链是连续合成，而后随链是合成不连续的冈崎片段，前导链和后随链都有自己单独的引发和DNA聚合反应。这种结构造成的原因就是在后随链的复制过程中，单链模板仅仅暴露了几千bp。 为了防止后随链形成二级结构阻止聚合反应，四聚体SSBs包裹在单链DNA上，形成的核酸蛋白复合体，这种结构有利于后随链的合成。DNA聚合酶III通过直接与SSB结合形成接口，再与这个核酸蛋白复合体结合，这对复制体的稳定和冈崎片段的起始都具有重要作用。在真核生物，也发现有SSBs和复制体的结合，说明该接口在DNA复制过程中被广泛应用。 DNA聚合酶III有两个核心酶（α，ε和θ亚基），每个核心酶都有自己的夹板β亚基，一个称为DNAX或者γ复合体的中心（由（τ/γ）3，δ，δ’，χ亚基组成）。DNAX催化β亚基上DNA装载，以及通过蛋白质相互作用整合复制体的功能，这种结构在前导链β亚基上DNA装载起始，以及新的冈崎片段的形成是必需的。有文献报道，β亚基上DNA装载是由DNAX上的（τ/γ）3/δ/δ’驱动的；χ/ψ亚复合体激活这种功能。χ亚基直接与SSB结合，形成接口具有多种功能。 这种功能的一种模型是：χ/SSB相互作用通过直接物理接触，在后随链β亚基装载DNA过程中，起稳定复合体的作用。 这种功能的第二种模型是：χ/SSB相互作用是冈崎片段的起始的必要步骤。 二、主要研究内容与实验结果 1. X射线晶体衍射χ/ψ/SSB-Ct复合体 由于缺少χ/SSB分子相互作用的基本结构数据，在DNA复制中研究χ/SSB复合体的功能受到限制。作者没能够获得χ/ψ亚基与完整的SSB保守C末端晶体结构，只获得了χ/ψ亚基与短片段的SSB的C末端晶体结构，这个短片段是SSB的C末端最常见的四个氨基酸残基，这个晶体的分辨率是1.85A。Fo-Fc电子密度图说明SSB-Ct结合在χ表面。 SSB-Ct结合的χ表面主要有疏水和带电荷的氨基酸残基组成，SSB-Ct上的F177在SSB-Ct与χ的相互作用中起锚定的作用，侧链基团与χ表面疏水口袋相结合，α-羧基与χ的128的Arg的侧链形成离子键。SSB-Ct的N末端的大多数氨基酸残基与χ上的碱性氨基酸残基结合（K132和R135），这对于两者的离子键相互作用非常重要。 2. χ/SSB接口对于体外的结合具有重要作用 χ亚基突变体，R128A，K132A，R135A 分子排阻法测定χ亚基的折叠情况，没有因为氨基酸残基改变发生剧烈变化。 通过等温滴定热量测定法来测定突变的χ/ψ与SSB的结合能力变化。 三，讨论 SSB与细胞DNA复制之间的相互作用机制的提出对复制体的稳定性以及在整个复制过程中DNA聚合酶滞后链的传递非常重要。这种机制是通过结构，生物以及基因实验的结合检测出来的。一个SSB CT肽的晶体结构W / C 复制的复杂性由大肠杆菌决定，允许生成不同的蛋白质与不稳定的WSSB结合位点。对比之前在引物传递中的作用，含有多种不稳定的SSB位点重组聚合酶支持生命力旺盛的DNA滞后链的体外合成。但是，变异的聚合酶在标准盐环境下也会发现环境的不稳定，包括不配对的头和滞后链的复制，引物通过领先链聚合酶参与梗阻，以及冈崎片段长度变短。相似的研究表明，复杂不稳定的W / SSB通过与温度相关的SOS诱导在体内产生的细胞，细胞丝随着染色体分离而生长的缺陷是与复制体的不稳定性和异常复制有关。这些研究结果 定义了复制体W / SSB在形成复合物中的作用，以及它在DNA复制中建立稳定点并保持领先和滞后链耦合中意想不到的重要性。 。