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枫叶色素含量的季节性变化测定实验方案 实验原理： 枫叶中的色素，当叶子中所含的叶绿素占主导地位时，绿色就为主色调，抑制了其他色素展现本来面目。入秋后，气温逐渐下降，叶绿素的合成速度受阻，破坏却与日俱增，到后来叶片中只剩下花青素、类胡萝卜等色素，于是它们便有机会尽情展现自己的如花娇颜。另外，随着秋季不断降温，尤其是霜降之后，为适应即将到来的寒冷气候，叶肉内积累了较多的糖分，这些糖分经过复杂的反应，形成了花青素，也由此形成了秋叶变红的重要基础 花青素：花青素是具有2-苯基苯并吡喃阳离子结构的衍生物，广泛存在于植物中的水溶性天然色素。花青素在自然状态下常与各种单糖形成糖苷，称为花色苷。溶液PH不同，花色苷的存在形式也不同。对于一个给定的PH值，在花色苷的4种结构之间存在着平衡：蓝色的醌式（脱水）碱，红色的花烊正离子，无色的甲醇假碱和查尔酮。花色苷在PH值很低时，其溶液呈现最强的红色。随着PH值的增大，花色苷的颜色将褪至无色，最后在高PH值时变成紫色或蓝色。PH示差法测定花色苷含量的依据是花色苷发色团的结构转换是PH的函数，起干扰作用的褐色降解物的特性不随PH变化。因此在花青素最大吸收波长下确定两个对花青苷吸光度差别最大但是对花色苷稳定的PH值。 根据Fuleki T经验公式 花青素含量（mg/100g)=△TO.D/(avE%1cm ×W ×10); △TO.D=△A×DV×VF; △A=A(pH1.0)-A(pH4.5). 其中：DV-----稀释体积；VF-----稀释倍数；W------样品重量；A-----总吸光值；avE%1cm------平均消光系数 代入数值计算： 叶绿素a.b: 叶绿素是由叶绿酸、叶绿醉和甲醇组成的二醇酷，是四毗咯衍生物， 其中的叶琳环是处于二氢形式，中心的金属原子为镁。蔬菜中的叶绿素有 叶绿素a和 叶绿素b两类。叶绿素在 植物细胞中与蛋白质结合成叶绿素蛋白 质，由多种叶绿素蛋白复合物构成叶绿体，当 细胞死亡之后，叶绿素就游离出来。叶绿 素 是 一种不稳定的物质.不耐光、热、酸、不溶于水，易溶于碱、乙醉与乙醚，在碱性溶液中，皂化为叶绿素碱盐。 叶绿素a、b在长波的最大吸收峰分别在663nm、645nm，据Lamber-Beer 定律，可得浓度C与光密度D间的关系式: D663=82.04Ca +9.27Cb D645=16.75Ca +45.6Cb (浓度单位：g/mL） 叶绿素a的浓度：Ca= 12.72D663 – 2.59D645 叶绿素b的浓度：Cb= 22.88D645 – 4.68 D663 总叶绿素的浓度：Ct = 20.29D645 +8.02D663 (浓度单位：mg/L） 材料与用品：枫叶提取液，乙醇95%（AR），盐酸 仪器：PHs-3B型酸度计，紫外分光光度计 丙酮、石英砂、碳酸钙 分光光度计、天平、剪刀、研钵、移液管、漏斗、大试管 实验步骤： 花青素测定： 1，将花青素取液稀释至一定的体积，用稀氢氧化钠和稀盐酸调节PH，观察提取液在不同PH下的颜色变化。对提取液进行200~800nm全波长扫描，绘制光谱图 PH 1.0 2.0 原液 4.5 9.5 溶液颜色 2.测定波长的选择 取枫叶花青素提取液用5%HCL-EtOH（15:85）溶液稀释至一定体积，进行光谱扫描，确定最大吸收波长。 紫外可见吸收光谱 3.PH示差法中PH的选择 在选定PH时应考虑以下因素：在此两个PH处测定的花青素的吸收值差异应是最显著的；单一PH的轻微变动，对花青素吸光值的影响是极小的；花青素在所处的两个PH下，应是相当稳定的。由于花青素只有在酸性介质中是稳定的，因此只测定PH小于7条件下花青素吸光值的变化。PH为1.0时，花青素以红色的2-苯基苯并吡喃的形式存在PH为4.5时，花青素以无色的甲醇假碱的形式存在。因此选择PH为1.0和4.5。 4.平衡时间的确定 因为花青素在溶液介质中存在4种结构形式，这4种结构形式在某一PH下处于动态平衡，当PH改变时，动态平衡发生转移，总的趋势是PH降低时，平衡向红色的2-苯基苯并吡喃阳离子移动；PH升高时平衡向蓝色醌式移动。一定时间后达到一个新的平衡。因此提取液用缓冲液稀释后，必须静置一段时间，等动态平衡处于稳定后，才能测定吸光值。 花青素在缓冲液中的吸光度值与时间的变化关系（λ= nm） T（min） 0 10 20 30 50 80 110 PH1.0 buffer PH4.5 buffer 结果表明，花青素在缓冲液中的吸光度值随时间变化，在PH1.0( )基本稳定，在PH4.