大鼠瘦素基因重组腺相关病毒的获取及在神经元细胞中的表达.docVIP

周传农修改： 英文摘要 — 已修改 正文中的英文书写 — 已顺 图的英文 — 已顺，已修改 文献的英文书写 — 已顺 大鼠瘦素基因重组腺相关病毒的构建及在原代神经元 细胞中的过表达 裴娜娜1，吴丽红2,4，高永新3，毛莹莹1，罗杰1，黄威2,4，刘闻2,4，张屹3，顾为望2,4，李红卫1 （南方医科大学1生物技术学院，2实验动物中心暨比较医学研究所，广东 广州510515, 3Malcom Randall Veterans Affairs Medical Center, Gainesville, FL 32608, USA, 4东莞松山湖明珠实验动物科技有限公司，广东 东莞 523808） 【摘要】 目的 构建携带大鼠瘦素(leptin)基因的重组腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，并鉴定其在原代鼠神经元细胞中介导的瘦素过表达，为肥胖症基因治疗研究奠定实验基础。 方法 提取大鼠脂肪组织总RNA，利用RT-PCR技术，获取目的基因瘦素 cDNA，通过重组DNA技术，得到瘦素 cDNA与pGEM-T载体的重组质粒，阳性重组子用PCR及测序分析鉴定。用Spe I和EcoR V双酶切将pGEM-Leptin中的瘦素基因片段切出，再克隆到AAV2表达质粒pTR-UF22中，构建瘦素重组AAV2载体pAAV2-CBA-Leptin。以pDG作为辅助质粒用HEK293细胞包装AAV2-CBA-Leptin，并用一步重力流柱法纯化病毒，由荧光定量PCR测定病毒基因组DNA的拷贝数即为病毒滴度。然后将AAV2-CBA-Leptin 及对照病毒AAV2-CBA-EGFP感染大鼠原代神经元细胞，分别用免疫染色和Western blotting鉴定外源基因在神经元的表达。 结果 测序证实瘦素基因与GenBank 提供的原始序列完全一致。 重组载体经酶切鉴定与预期结果完全一致，HEK293细胞包装病毒效果良好，得到滴度为1.5x1012 vg/mL纯化的重组瘦素病毒AAV2-CBA--Leptin。Western blotting检测显示AAV2-CBA-Leptin能介导瘦素在大鼠神经元细胞中过表达，并随着病毒量的增加而增强。AAV2-CBA-EGFP 感染鼠神经元细胞5天后95%左右的细胞有明显的绿色荧光，免疫染色和DAPI核酸染色显示荧光细胞均为神经元而神经胶质细胞无荧光。 结论 成功构建并包装了瘦素重组AAV2病毒并可介导瘦素在神经元细胞中高效、特异表达，从而为研究瘦素在中枢神经系统控制体重和糖尿病等方面的功能及基因治疗研究打下基础。 【关键词】 瘦素；腺相关病毒载体；神经元细胞；肥胖；糖尿病 Construction and validation of neuronal transduction of the leptin recombinant adeno-associated virus 2 vector Construction of rat leptin recombinant adeno-associated virus 2 vector and its overexpression in primary cultured neurons PEI Na-na1, WU Li-hong2,4, GAO Yong-xin3, MAO Ying-ying1, LUO Jie1, HUANG Wei2,4, LIU Wen2,4, ZHANG Yi3, GU Wei-wang2,4, LI Hong-wei1 (1. School of Biotechnology, 2. Laboratory Animal Center at Southern Medical University, Guangzhou 510515, China; 3. Research Department, Malcom Randall Veterans Affairs Medical Center, Gainesville, FL 32608, USA; 4. P [Abstract] Objective The aim of this work was to construct a recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector containing rat leptin gene, which mediates transduction of leptin into rat neurons in primary culture. Methods The leptin cDNA was obtained from rat adipose