毛细管电泳分析解析.pptVIP

图表面活性对分离的影响示意图 A: 未加表面活性的分离效果, B:加入表面活性的分离效果 5 进样方式 由于毛细管的内径非常细，其进样方式与常规电泳和层析的进样方式有所不同。毛细管电泳的进样方式主要有两类，一类是电迁移进样，另一类是流体力学进样。 5.1 电动式进样 (1)电迁移进样(Electrokinetic)： 将毛细管的阳极直接与样品接触，短时间内施加电压，使样品通过电迁移的方式进入毛细管的阳极端。 进样量：与溶质浓度，加电压的强度E，电迁移时间t，电迁移速度Vep，电渗速度Veo等因素有关。 优点：进样准确，容易控制重复性好。 缺点：对浓度低的组分有歧视效应。 (2)电击进样: 在毛细管的阳极端通过电击方法将样液送入毛细管内。 进样量：与溶质浓度C，电击所使用的功率，电击次数等因素有关 优点：应用广泛， 缺点：上样两不容易控制。 5.2流体力学进样 (1)虹吸进样： 进样时将阳极槽抬高形成槽的落差，利用液体重力差将样品吸入阳极端的毛细管内。 进样：量与落差、样品浓度、进样时间成正比，与样液粘度成反比 优点：操作简便，重复性好。 缺点：比较适于自由电泳，而不是与凝胶电泳。 (2)加压进样： 进样时将阳极端密闭，施加一定的液压把样品吸入毛细管内。 进样量：与液压强度、样品浓度、进样时间成正比，与样液粘度成反比。 (3)真空进样 利用两端的气压差将样品送入毛细管内。 进样量：与真空度、样品浓度、进样时间成正比，与粘度成反比。 6毛细管电泳的分离模式： 由于毛细管电泳时在微细的管中进行的，它的操作模和分离机理式与高效液相层析相似，二者之间所不同的是驱动力。前者是电力驱动，后者是压力驱动。 6.1毛细管区带电泳 (1)原理： 毛细管区带电泳，亦称为毛细管自由溶液电泳毛细管区带电泳，是毛细管电泳中最简单的一种分离模式。其分离机理是根据被分离组分的净电荷与质量之间比值，各组分表面电荷密度的差异进行分离的。在进行毛细管电泳时，要求缓冲液具有均一性，毛细管内壁具有恒定的电场强度。 (2)分离条件的选择: 工作电压的选择：在进行毛细管电泳时，随着电压的增大，可缩短分离的组分在柱内的停留时间，提高柱效。但是随着电压的增大焦耳热的产生也增多，如果冷却系统不好，柱效反而下降。 缓冲液的选择：CZE电泳中的缓冲液，一般可选择磷酸、醋酸或硼酸等弱酸作缓冲液。但是缓冲液的pH值和浓度是很重要的，选择的原则是缓冲液的pH值必须比被分离组分的等电点高于或低于1个pH单位以上，以便能得到合适的电泳淌度。 常用的缓冲液见下表。 表4常用的缓冲液及pH值 缓冲液 pH 值 两性缓冲液 pH 值 磷 酸 醋酸盐 磷酸盐 硼酸盐 1.14－3.14 3.76-5.76 6.20-8.20 8.14-10.14 MES PIPES HEPES Tricne 5.15-7.15 5.80-7.80 6.55-8.55 7.15-9.15 ? 缓冲液的添加剂：在缓冲液中加入合适的添加剂，不但可以改善分离的选择性，且还可以改善电泳淌度。常用的添加剂见表5： 表5：添加剂与及其功能 添 加 剂 功 能 无机盐 有机溶剂 尿素 磺酸 胺类 表面活性剂 纤维素衍生物 改变蛋白质的结构 增加溶解度，减少电渗 增加蛋白质溶解度，使低聚核苷酸变性 增加离子对，起疏水作用 覆盖硅烷基团 改变毛细管内壁的特性 减少电渗起筛泸作用 ? * 高效毛细管电泳 ? 内容摘要 ? 1概述 2基本理论 3毛细管电泳仪 4 电极液 5 进样方式 6毛细管电泳的分离模式 1概述 1.1高效毛细管电泳提出 高效毛细管电泳(High Performance Capillary Electrophoresis，简称HPCE)，广义的说，是泛指在极细的管内实现具有高效、快速、灵敏度高的一大类电泳分析技术，称之为高效毛细管电泳。 高效毛细管电的发展过程大致分为以下几个阶段 1967年Hjerten首先提出在高电场强度下，采用管径为3mm的毛细管进行自由溶液的区带电泳。 1974年Virtan采用内径为200－500?m的毛细管进行电泳，使毛细管的内径缩小了6－15倍。 1981年Jorgenson和Lukass使用内径为75?m的毛细管进行电泳，使毛细管的内径缩小了3－6倍。 1984年Terabe等把胶束电泳技术引入到毛细管电泳中，为今后发展新型的毛细管电泳分离模式提供了