实验基本技术.pptVIP

PCR基本成分 template primers Taq polymerase 10×PCR buffer dNTPs Mg++ PCR Primers PCR Primers 序列发现的时间和发现者 序列的生物体来源 序列的组织来源 引物设计 引物长度（length）: 20～30bp 引物中四种碱基的分布应该是随机的 两引物间不能有互补序列，尤其是3‘端 引物的碱基顺序不应与非扩增区域由同源性 引物的3’末端碱基一定要与模板DNA配对 可以在5’末端加上限制性内切酶位点或起始密码 解链温度(Tm)：两引物间相差不大于5℃ 引物内部不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列存在 PCR基本程序 预变性（Pre-denaturation) 变性(Denaturation) 退火(Annealing) 延伸(Elongation) 25-30 cycles PCR反应 取无菌0?2ml PCR管一支，加入： 10?PCR缓冲液 5μl 氯化镁 4μl 4种ｄNTP混合液(10mmol/L) 0?5μl 3?端引物(10μmol/L) 1μl 5?端引物(10μmol/L) 1μl Taq DNA多聚酶(5u/μl) 0?25μl 三蒸水 33?25μl 模板cDNA 5μl 盖紧盖子，离心数秒后置PCR仪上进行扩增。PCR循环为：95℃预变性2 min，95℃变性30 s、55℃复性30 s、72℃延伸1 min， 30个循环，最后72?C延伸7 min。 细胞裂解 RNA释放 cDNA PCR扩增 逆转录酶 耐热 DNA聚合酶 RT-PCR扩增 引物 dNTPs 二价金属离子 DNA聚合酶 引物 dNTPs 二价金属离子 逆转录酶 RT-PCR过程 逆转录酶/耐热DNA聚合酶 琼脂糖凝胶电泳技术 琼脂糖凝胶电泳基本原理 琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖作为固体支持物的一种电泳方法。 因为各种核酸分子的电荷及质量之比是相近的，在没有支持物的电场中，它们以相同的速度前进。 琼脂糖凝胶电泳具有分子筛效应，所以在适当浓度的琼脂糖凝胶中电泳，线性DNA分子在电场中的迁移率与其分子量的对数成反比，从而达到分离的目的。 琼脂糖凝胶电泳分离的原理 使 TAE浸过凝胶表面 在阴极的加样孔加样（红正黑负） 分子筛作用 分子量越小，迁移速度越快 琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围Separation Range Vs. % Agarose 琼脂糖凝胶浓度与分离效率 大片段在 0.7%琼脂糖凝胶中分离效果好 小片段在 1.5%琼脂糖凝胶中分离效果好 注意事项 一定要等凝胶冷却至60℃时再入加溴化乙锭 切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样 孔的一端为负) 加完样品后最好先观察一段时间 插电极或拔电极时必须将仪器电源关掉 不要使样品跑出凝胶 谢 谢！ * 逆转录体系主要包括： 引物 逆转录反应介导物 RNA模板 被逆转录目的物 逆转录酶 逆转录反应催化剂 dNTPs 反应底物 缓冲液 提供反应环境 锰离子（其他二价金属离子） 逆转录酶活性依赖离子 * 1.内源性过氧化物酶的消除方法：0.3%～3%H2O2甲醇液20min；1％ H2O2 20min；3％苯肼溶液37℃1h；0.075%盐酸甲醇液 30min等。2.内源性碱性磷酸酶的消除方法：10％醋酸 10min；0.5mol/L碳酸氢钠（pH9.0） 20min；1mol/L左旋咪唑 20min。3.内源性生物素的消除方法：2-甲基-D苷露糖饱和生物素；先用25μg/ml卵白素孵育15min，PBS洗10min，移至生物素饱和液中处理15min，PBS洗15min。 2、内源性酶的消除方法 1.抗原修复(Antigen Retrieval;AR)是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。 2.修复方式：①微波96℃±10min×2；②直接加温100℃，15min；③水浴锅100℃，15min；④高压锅/消毒锅120℃，5min；⑤真空加热10min；⑥直接烤片法。 3、热诱导的抗原修复  3.修复介质： ①0.01M pH6.0柠檬酸缓冲液(CB)；②0.05mTris-HCL(pH1-12系列);③0.01M pH7.0 PBS;④2%硫酸铝；⑤2％硝酸铝；⑥生理盐水；⑦蒸