实验13：PCR技术研究.pptVIP

* * Same basic format as with standard PCR. However, the Intercalation Dye is also included. Very low background when not bound to dsDNA. * * * * * Same basic format as standard PCR. * Detection is performed at the annealing step due to the opening of the probe. The binding and unfolding of the probe is because it is energetically more favorable to bind the target sequence than to remain in the folded conformation. * This approach requires the binding of probes closely together (within 1-5 bases). Differs form other approaches in that the energy is transferred from the first fluorophore to the second. The fluorescence of the second fluorophore is then analyzed. * Please go through the animation this is a presentation of the set of quenchers that we have working well with the different fluorophores. See the detailed information on these fluorophores and quenchers on the previous slide notes. 5 3 F Q Tubulin 5 3 H Q GapdH 5 3 TX Q b-actin 5 3 Cy5 Q Cyclophilin 多色荧光检测技术 ——同时检测4色荧光 3、荧光定量PCR的应用 相对定量：基因在不同组织中的表达差异、药物疗效考核 绝对定量：基因表达研究、病原体检测、转基因食品检测 相对定量 参考基因：Actin, GAPDH, 18sRNA 靶基因A GAPDH ΔCt 对照组 25.2 19.5 5.7 实验组 22.1 20.8 1.3 1．计算ΔCt：ΔCt=Ct 靶基因－Ct GAPDH，分别计算实验组和对照组的ΔCt。 2．计算ΔΔCt：ΔΔCt=ΔCt实验组－ΔCt对照组，本例中ΔΔCt= －4.4。 3．计算相对表达量的差值。2 －ΔΔCt 绝对定量 构建标准曲线： A、按照扩增片段的序列，人工合成一段寡聚核苷酸。 B、利用纯化的扩增产物制备 C、克隆有扩增产物的质粒 标准品的选择： 标准品可以从厂家购买，也可以自己制备 标准品的单位，取决于对最终结果的要求：拷贝数，%，ng/uL, mol/uL（如：如果要得出的是样品中的基因拷贝数，则梯度稀释已知摩尔浓度的DNA）  荧光强度的校正 影响荧光信号强度的因素包括： 光源强度、管盖透光性能 缓冲液用量、反应体积、PCR反应强度等等 以扩增前的荧光探针本底信号为依据，荧光强度归一化校正。 内参照荧光Rox校正。 PCR扩增效率的校正 利用多色荧光检测技术对内标荧光的检测可校正PCR扩增效率误差。 实验误差校正技术——准确定量 （六）兼并引物PCR（Degenerate Primer） 1、密码子的兼并性 氨基酸　　　　　　　　　　　　　　　　密码子数 Ｍ、Ｗ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｙ　　　　２ Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３ Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｖ　　　　　　　　　　　　４ Ｌ、Ｒ、Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　　６ 2、概念 兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。兼并度越低，产物特异性越强。设计引物时应尽量选择兼并性小的氨基酸，并避免引物3末端兼并，因为3端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR；次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。 （七）巢氏PCR（Nested PCR） 巢氏PCR需要两到三对引物，一般采用第一套引物扩增15-30个循环，