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蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。 第十节 蛋白质分离纯化及测定 一. 蛋白质分离纯化的方法 根据分子大小 根据溶解性 根据电荷 根据吸附力 根据特异性亲和力 透析/超过滤法 密度梯度离心法 凝胶过滤法 PI沉淀法 盐溶和盐析法 电泳法 离子交换法 凝胶过滤法 凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构 一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外 洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大 测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名： Sephadex 二. 蛋白质浓度测定的方法 1.福林试剂反应 福林试剂：磷钼酸-磷钨酸将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨 蓝混合物。酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应） 2.双缩脲法 在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应 蛋白质-铜络合物，灵敏度提高100倍 3.考马斯亮蓝G-250 本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色，与蛋白的亲和力强，灵敏度高， 1---1000微克/毫升 4.凯氏定氮法 5.紫外吸收法 第四节 肽 一.肽的结构 氨基酸残基 肽单位 二.生物活性肽 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- Met-脑啡肽 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Leu-脑啡肽 H2N-CHCH2CH2-CO-NH-CH-CO-NH-CH2COOH COOH CH2 SH 2GSH GS-SG 1.谷胱甘肽 2.脑啡肽 Leu-(D)phe-pro-val-Orn Orn-val-pro-(D)phe-Leu 4.短杆菌肽S（Orn鸟氨酸） 3.催产素 第五节 蛋白质分类 一.根据蛋白质分子形状分类 1.球状蛋白 2.纤维状蛋白 二.根据蛋白质的组成成份分类 1.单纯蛋白 2.结合蛋白 清蛋白 核蛋白 谷蛋白和醇溶谷蛋白 色蛋白 精蛋白和组蛋白 糖蛋白 硬蛋白 脂蛋白 磷蛋白 第六节 蛋白质的一级结构 一.蛋白质的氨基酸组成 1.蛋白质的氨基酸组成可用残基重量百分数表示 147 165 如：100克胰岛素 分析得到 phe8.6克，其重量百分数为： 残基分子量 氨基酸含量 * = 8.6 * = 7.7克 氨基酸分子量 2.根据百分组成计算氨基酸的分子个数 如：胰岛素分子量为6000，丙氨酸占4.6%，氨基酸个数为： = = 3 4.6%*6000 89 氨基酸的百分含量*蛋白质分子量 氨基酸的分子量 a盐键（离子键 ） b氢键 c疏水相互作用力 d 范德华力 e二硫键 f 酯键 二.蛋白质分子结构中的化学键 维系蛋白质分子的一级结构：肽键 维系蛋白质分子的二级结构：氢键 维系蛋白质分子的三级结构：疏水相 互作用力 维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键、氢键、疏水相互作用力 离子键 氢键 范德华力 疏水相互作用力 氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键 氢键、范德华力虽然键能小，但数量大 疏水相互作用力对维持三级结构特别重要 盐键数量小 二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定 三.蛋白质一级结构的测定 （一）氨基酸组成成分分析 （二）末端分析 1.N-末端 2.C-末端 （三）肽链伸展与分离 （四）肽链部分水解与肽段分离 （五）肽段的氨基酸顺序测定 （六）由各段顺序推断的氨基酸顺序 化学法： 溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。 酶法 -HN-CH-CO-NH-CH-CO—— R1