实验七-胶体金免疫层析技术.ppt

与常规诊断方法相比 技术应用 基本原理 是将已知的特异性抗原或抗体固定于硝酸纤维素膜上某一区带作为检测带，在样品区滴加样品后，借助毛细作用，样品泳动至玻璃纤维膜，金标复合物溶解，并与样品进行抗原抗体反应，形成复合物，继续泳动至硝酸纤维素膜的检测区，带有金标记的复合物被检测区抗原或抗体捕获，呈现红色条带。如样品中没有待测抗原或抗体，则不发生结合，即不显色。在硝酸纤维素膜检测区附近一般再固定上针对金标结合物相应的抗原或抗体作为质控带，无论样品中有无待测物，质控线都应显示，如无，则检测失败。整个过程一般在15分钟内完成，操作简单、快速，且不需任何仪器。 免疫胶体金的制备 胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。蛋白质的预处理:1.蛋白质应先对低离子强度的水透析，去除盐类成份。盐类成份能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在。 2.用微孔滤膜或超速离心除去蛋白质溶液中的细小微粒。 3.胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或略偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。  蛋白质最适用量测定: 将待标记的蛋白质（鼠抗人IgG）储存液作系列稀释后，分别取0.1ml加到 1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2小时。 不稳定的金溶胶将发生聚沉，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10％，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。  胶体金与蛋白质偶联后，加入稳定剂，以避免产生凝集。一般选用PEG（分子量为20000）和牛血清白蛋白作稳定剂。加入的量：5％BSA使溶液终浓度为1%；1%聚乙二醇加至总溶液的1/10。 ①用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH。②于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液搅拌2～3分钟。③加入5ml1%PEG20000溶液。④于10000～100000g离心30～60分钟小心吸去上清液（切忌倾倒）。⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以 A540nm=1.5左右为宜，防腐置4℃保存。⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含 0.1%BSA的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2。　　以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。 胶体金蛋白结合物的质量鉴定 平均直径的测量：用支持膜的镍网（铜网也可）蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。计算100个金颗粒的平均直径。 OD520nm值测定：用PBS液（含1%BSA）将胶体金蛋白试剂作1:20稀释，OD520＝0.25左右。一般应用液的OD520应为0.2～0.4。 金标记蛋白的特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色法。将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或抗原）以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。 胶体金蛋白结合物玻璃纤维素膜制备 胶体金标记的鼠抗人IgG放入玻璃纤维素膜浸泡10分钟，取出至37度烤箱中烤干，热合封口，置4摄氏度冰箱备用。(实验阶段） 用喷点仪将胶体金标记的鼠抗人IgG喷在玻璃纤维素膜上,真空干燥2 h 。 （生产阶段） 选择NC膜 NC膜的选择 爬速(???秒/4cm)对灵敏度的影响 通过同一T线喷点位置时, 金溶液通过的速度是快速膜慢速膜. 那么通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短, 读数快, 那么灵敏度也就越低. 反之, 反应时间长, 读数慢, 也就灵敏度高。 同时还有一个问题是, 反应时间越长, 发生非特异性结合的可能性就越大, 所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度.。所以这里就有一个读数时间/反应灵敏度/非特异性结合的均衡. 不同膜厂家的产品 (Whatman,Millipore,Sartorius) 大致为: 135s和180s 抗原、抗体包被固相NC