第8章发酵机制.pptVIP

而糖酵解和三羧酸循环中间代谢物含量增高（见表4-3），可见，锰缺乏时黑曲霉的组成代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。 当黑曲霉菌生长在缺锰的高浓度糖培养基中时，细胞内NH4+异常高（25mmol/L，随之出现几种氨基酸：谷氨酸、谷氨酰胺、鸟氨酸、精氨酸和-氨基丁酸）的积累和分泌，使NH4+对细胞的毒性被解除。 这些氨基酸的积累可能是由于蛋白质合成受干扰，从而导致蛋白质分解相应增加，细胞内蛋白质和核酸的减少所致。有锰离子存在时，添加环已酰亚胺（Cycloheximide）可以促进NH3+和氨基酸积累。 由此可得到结论， NH3+积累是由于蛋白质和RNA转换过程中细胞蛋白质的再合成受损失伤引进的，后者是由于Mn2+缺乏所致。虽然这过程中Mn2+的主要作用是什么仍不清楚，但在添加Mn2+后要经过几个时的延迟，并需要通过细胞质蛋白质（不是线粒体蛋白质）的合成才对柠檬酸发酵产生抑制效应。细胞质蛋白质的合成被环己酰亚胺所拮抗，而不被氯霉素拮抗。可以认为Mn2+的效应是通过NH3+水平升高而减少柠檬酸对PFK的抑制， NH3+水平升高是因Mn2+缺乏使蛋白质和核酸合成受阻。 Mn2+对棒杆菌核苷酸积累的专一性影响和上述例子极为相似。关于核苷酸的积累，人们推断是因为催化核糖核苷酸形成聚合阶段第一步反应的酶需要锰。 某些真菌的丙酮酸是酵解过程第二个调节点已被证明，但是关于黑曲霉尚未被证明。用交换定理未能确定这一步反应是否调节性。测定柠檬酸发酵时酵解中间代谢物浓度可推断流经丙酮酸激酶的通量增加。 丙酮酸是真菌糖代谢的一个重要分叉点，丙酮酸既可以由丙酮酸脱氢酶催化氧化脱羧生成乙酰-CoA，也可以由丙酮酸羧化催化经CO2固定生成草酰乙酸。 CO2固定的强度对柠檬酸高产率的一个重要条件。黑曲霉的丙酮酸羧化酶已被提纯，与其他真菌相反，此酶不被乙酰-CoA抑制，α-酮戊二酸只有微弱的抑制作用，该酶的调节性很差。Feir（1969年）Johnson（1962年）、Wongchai（1974年）的研究指出此酶是组成型。 二、三羧酸循环的调节 在许多细胞中三羧酸循环起始酶——柠檬酸合成酶是一种调节酶。然而根据柠檬酸合成与CO2固定之间的关系为化学计量关系，可以推断黑曲霉的柠檬酸合成酶没有调节作用。 从理论上推测，顺乌头酸水合酶失活，TCA循环阻断是积累柠檬酸的必要条件，顺乌头酸水合酶需要Fe2+。也有人报道，在积累柠檬酸时，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活。 La. Naze等（1966年）比较了在不同产率的柠檬酸发酵中，顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶的活性，在柠檬酸产生和不产生时均存在。供给铜0.3mg/L，铁2mg/L ，和pH2.0情况下，这三种酶均不呈现活性。发酵中柠檬酸正是在这个酸度下积累的，因此他们认为细胞内pH2.0，上述三种酶失活是由于酸度太高造成的。但不能解释为什么pH值会下降，即柠檬酸开始如何积累。 最近研究表明，黑曲霉中有一种单纯的，位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面平衡： 柠檬酸∶顺乌头酸∶异柠檬酸=90∶3∶7 TCA循环在柠檬酸积累中所起的作用可归纳为： （1）大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键； （2）丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或极微弱，而且这二个反应的平衡，保证了草酰乙酸的提供，增加柠檬酸合成能力； （3）TCA循环的阻断或微弱（即顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶活力降低），导致循环中间代谢物积累，由于各种酶处于平衡状态，使柠檬酸积累，当柠檬酸浓度超过一定水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。 综上所述，柠檬酸的积累机制可归纳为： 由于锰离子缺乏抑制了蛋白质合成，导致细胞内NH3+浓度升高和有一条不产生ATP的侧系呼吸链，这两方面的原因分别解除了对PFK的代谢调节，促进了EMP途径的畅通。由于丙酮酸羧化酶是组成型，不被调节控制，就源源不断地提供草酰乙酸。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA和CO2固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸能力。由于顺乌头酸水合酶在催化时建立以下平衡： 柠檬酸∶顺乌头酸∶异柠檬酸=90∶3∶7 同时在控制Fe2+含量时，顺乌头酸水合酶活力低，使柠檬酸积累，一旦柠檬酸浓度升高到某一水平就抑制异柠檬酸脱氢酶活力，从而进一步促进了柠檬酸自身积累。柠檬酸的积累使pH值下降，在低pH值下降，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，就更有利于柠檬酸的积累并排出体外。 第七节 乙醛酸循环和醋酸发酵柠檬酸 上述理论能够解释生成柠檬酸，而不能解释乙醇和醋酸或烃类发酵生成柠檬酸。 由于丙酮酸氧化脱羧反应是不可逆的。因此草酰乙酸的供给只能由乙醛酸循环来完成。Olsen（1954