qPCR实验从设计primer开始到 计算方法详例.docVIP

. . 本人在日本留学 虽然对于具体的原理不是特别理解，现把详细的实验real time PCR 的实验方法写出来让大家来参考。 第一步： primer 设计 Primer design: Find out the mRNA of related gene, for example: Mus musculus transgelin(Tagln) SM22a, mRNA /nuccore/NM_011526.5 NCBI Nucleotide GenBank open the website of Primer-Blast /tools/primer-blast/ Enter accession, gi, or FASTA NCBI Reference Sequnece:NM_011526.5 , range Write the organism that you use for mice for homo sapiens, mice: Mus musculus (taxid:10090) Primer pair 1 Sequence (5-3) Template strand Length Start Stop Tm GC% Self complementarity Self 3 complementarity Forward primer GCTTTGGGCAGTTTGGCTGT Plus 20 631 650 62.03 55.00 3.00 0.00 Reverse primer TCTTATGCTCCTGGGCTTTCTTCA Minus 24 718 695 61.86 45.83 3.00 1.00 Product length 88 Exon junction 698/699 (reverse primer) on template? NM_011526.5 将设计的primer 序列交给公司合成就可以了。 提取mRNA 对于组织，如血管。 在冷的PBS液体中取出血管后马上放入液氮中。带全部样品提取完后， 用粉碎机粉碎。 大概20次/秒速度， 10秒每次，3次。 加入1ml Trizon, 常温静止30min 放于冰上， 加入200ul chloroform，震荡混匀。 13000rpm, 4℃， 离心10-15min 取上清液， 大概500-600ul 加入500ul 2-propronaol， 震荡混匀， 13000rpm, 4℃， 离心10-15min。（因小鼠组织太小， 加入了4ul Dr.gene, precipitation） 去掉液体， 加入80%酒精500ul(一定要用无核酸酶的水， PCR 用水)， 离心13000rpm, 4℃， 10-15min， 重复操作2-3次。 去液体， 干燥，加入PCR用水， 溶解mRNA 测量RNA 含量。 定量RNA含量，保证样品中有650ng/ul RT-RCR 5*buffer 4ul dNTP 8ul Radom primer 1ul RTace 0.5ul RPI 0.5ul mRNA: 6ul 30℃， 10min； 42℃，60min；99℃， 5min；4℃， ∞ 完成后 稀释样品5倍保存待用。 18s做内参在保存用样品的基础上再稀释50倍。 Real-time PCR 每个样品做1次重复 SYBR qPCR mix: 7.5ul ROX: 0.3ul Primer F: 0.5025ul Primer R: 0.5025ul DW 4.695 cDNA: 1.75 HOT start: 1min , 95 ℃， 1cycle； Amp.2 step: 15s, 95℃；45s， 60℃， 50cycle， Melt: 30s, 95℃。 完成后， ROX 做为reference， 导出Ct值 最后结果Ct值计算方式例子 如： 得到的值为 sample Target Ct WT1 18s 9.7 WT2 18s 9.84 WT3 18s 9.98 KO1 18s 9.73 KO2 18s 9.61 KO3 18s 9.52 WT1 actin 31.95 WT2 actin 32.83 WT3 actin 33.69 KO1 actin 34.07 KO2 actin 34.59 KO3 actin 41.61 计算actin – 18s值 （Δct） sample