细胞融合以及单克隆技术.ppt

第五章 细胞融合与单克隆抗体 细胞融合实际上包含多个过程：首先是两个亲本细胞并列，以后膜组织局部破坏，最终形成包围融合细胞的连续胞膜。融合细胞表现的特征性变化，有膜成分和胞质成分的交流以及细胞内电导率的连续性。 抗体的主要类型与结构： ? IgG由4条多肽组成(两条轻链和两条重键) ，通过二硫键和非共价键相连，其分子结构如“Y”型。一端为抗原结合端(氨基端)——可变区(V区)，即氨基酸顺序随免疫的抗原不同而异，有两个相同的能与抗原结合的部位。另一端(羧基端)氨基酸顺序排列比较恒定——恒定区(C区)，可与具有Fc受体的细胞相结合(如巨噬细胞、K细胞、肥大细胞等)，分别产生不同的效应。 IgG抗体结构模型（红色部分为CDR区域） 抗体与抗原的特异性结合 HAT系统为次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)的缩写。它是根据嘌呤和嘧啶生物合成途径设计的分离杂种细胞特殊的培养基。 细胞内核苷酸的生物合成有两条途径： 一条是主要途径，该途径中叶酸及其衍生物是必不可少的，氨基喋呤可抑制二氢叶酸还原酶活性，从而阻断细胞中DNA的合成； 另外一条是补救途径，该途径需要两种酶参与。一种是HGPRT酶(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶) ，另一种酶是TK酶(胸腺嘧啶核苷激酶) 。它们可以分别利用次黄嘌呤催化产生的肌苷酸及胸腺嘧啶核苷催化产生的脱氧胸苷来合成DNA。 H、T为应急途径时提供外源核苷酸“前体”。 ? 在氨基喋呤存在时，阻断了核苷酸的从头合成IMP的途径，细胞只能通过HGPRT使次黄嘌呤酸化形成次黄苷酸，再依次转化为AMP及GMP，即通过“补救途径”依赖外源来合成核苷酸。 因此，一个HGPRT－或TK－的细胞株不可能在含HAT的培养液中生长。但这样的细胞与能提供HGPRT或TK酶的细胞融合后，杂交细胞能在含HAT培养液中存活下来。 ? 如果融合细胞的亲本之一是一个能在体外长期生存的骨髓瘤细胞系，而另一个亲本细胞是体外增殖能力有限的正常细胞。 如将长期培养系突变为HGPRT或TK酶缺陷型的细胞系，在和正常细胞融合后，未经融合或自身融合的骨髓瘤细胞在HAT培养液中死亡；未融合或自身融合的正常细胞在体外生存能力有限最终也死亡。存活下来的只有融合细胞。 ? 骨髓瘤细胞易在培养基中生长；利用细胞融合法将骨髓瘤细胞永久生长的特性导入可生产有用抗体的 B 细胞中，则得到可在培养基中永久生长的 B 细胞株，此即杂交瘤细胞株。 得到的杂交瘤细胞既具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力，又具有肿瘤细胞在体外无限增殖的特点，可不断在细胞培养上清液中产生单抗。 （四）免疫动物 ? 1.动物选择 目的：是希望B细胞在抗原刺激下分化增殖，使之有利于融合成杂交瘤细胞，尤其是能分泌特异性抗体的杂交瘤融合细胞频率增加。 ? 动物选择应与骨髓瘤细胞来源相同的同一品系动物，多为BALB/c小鼠。 ? 2.抗原与载体 抗原可分为可溶性抗原（蛋白质、核酸、多糖、多肽等）和颗粒性抗原（细胞、病毒、细菌等）。 一般颗粒性抗原都有较强的抗原性，免疫时可不加佐剂；而可溶性抗原免疫时需加佐剂。 初次免疫时一般用完全弗氏佐剂将抗原制成乳剂，而以后加强免疫时一般用不完全弗氏佐剂制成乳剂进行免疫。 ?3.免疫途径 不同抗原可经不同途径进行免疫，主要有腹腔注射、皮下淋巴样器官注射、静脉注射、脾内免疫等，最常用的途径是腹腔注射。 ?a.腹腔注射：几乎适合于所有抗原体，特别适合于颗粒性抗原，经腹腔注射免疫时还可使用佐剂。 ?b.皮下淋巴样器官注射：多适用于可溶性抗原，多点注射有利于提高免疫效果。 ?c.静脉注射：不宜用于大颗粒性抗原，不宜作为初次免疫途径，也不宜加入佐剂，以免引起血栓或过敏反应。 ?d.脾内免疫：适于抗原量特别少的情况下使用，但脾内免疫多不产生明显的血清抗体，对免疫效果的判断有一定影响。 （五）亲本细胞的准备 ? 1. 脾细胞的分离: 一般动物需经多次加强免疫后才能获得大量的分泌抗体的B细胞。在末次免疫后3～5天左右即可取脾脏或淋巴结细胞分离淋巴细胞(大多为B细胞)用于与骨髓癌细胞进行细胞融合。 ? 分离脾细胞可用脾内注射培养基轻轻挤压使淋巴细胞逸出的方法，也可用不锈钢网挤压法分离淋巴细胞。 ?2.特异性抗原的富集 分离的脾细胞中含有对抗原具有特异性的B细胞比例相对较少，可以对抗原特异性的B细胞进行富集。 ? 将抗原包被在培养板或其他基质上，然后与脾细胞结合，那些表面具有特异性抗体的B细胞与抗原结合使得B细胞黏附于培养板或基质上，轻轻洗涤除去不黏附的细胞，留下的细胞为具有特异