内毒素的检测鲎试验.pdf

内毒素的检测 （鲎试验） 内毒素主要生物学活性有： 致热作用；白细胞反应；感染性休克；DIC等。 需要用来检测内毒素的情况： 用来检测所配置的输液用品或生物制品中是否 含有内毒素； 临床上为了及时地确定患者是否有G-菌感染 （内毒素休克）引起的内毒素血症。 鲎试验法是国际上至今为止检测内毒素最好的方法，它 简单﹑快速 ﹑灵敏 ﹑准确，因而被欧美药典及我国药典 定为法定内毒素检查法，并已被世界各国所采用。鲎试 验灵敏度高，可检测小于10ng/ml的内毒素。 鲎试剂按实验方法可分为:凝胶法、动态浊度法、终点浊 度法、动态显色法、终点显色法。凝胶法操作简单，经 济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。 实验原理： 鲎试剂为海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无 菌冷冻干燥品。鲎试剂中含有C因子、B因子、凝固酶 原、凝固蛋白原。在适宜的条件下 （温度、pH值及无 干扰物质），细菌内毒素激活C因子，引起一系列酶 促反应，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。 试剂和器材： 1.试剂：鲎试剂、细菌内毒素工作标准品、细菌 内毒素检查用水 2.器材：除热原吸头、稀释内毒素工作标准品用 玻璃试管、漩涡混匀仪、加样枪、恒温水浴箱 注意：接触试剂及供试品的所有器皿必须除热原 及无干扰因子。耐热器皿可经干热灭菌法 （250℃干烤30min以上）去除热原。 鲎试剂：冻干粉，本品为20EU λ为鲎试剂的灵敏度标示值，用EU/ml表示， 本品λ 0.25EU/ml 细菌内毒素工作标准品 1 .溶解：本品为白色疏松海绵状固体， 20EU/ 支。加入1ml细菌内毒素检查用水， 复溶后置漩涡混匀器上混匀15min。 2.稀释：用细菌内毒素检查用水进一步稀释 成浓度为4 λ （1EU/ml）的内毒素工作液， 稀释时应再涡旋1min待用。 实验方法： 1.取两支鲎试剂打开，分别加入0.1ml细菌内毒 素检查用水，轻轻振摇使之完全溶解，不要引 起气泡。溶解后的试剂应在10min内使用。 2.其中一支加入0.1ml内毒素工作液，标记上实 验组 （Sample ），另一支加入0.1ml内毒素检 查用水，作为对照 （Control）。 3.垂直放入37℃恒温水浴箱中温育60min ，温 育期间避免振动。 结果判断： 将试管从恒温器中轻轻取出，缓慢倒 转180°。若管内的内容物呈坚实凝胶， 不变形，不从管壁滑脱为阳性 （+）； 不呈凝胶或虽生成凝胶但不能保持完 整并从管壁滑脱为阴性 （-）。 结果分析： 若阴性对照管为阳性，提示鲎试剂、细菌内 毒素检查用水或实验器具可能受到污染。 若阳性对照管为阴性，提示鲎试剂活性减失、 灵敏度标示不准确，内毒素标准溶液效价降 低、稀释不正确。 鲎试剂4盒，40支，预实验用5支，现有35支 每组需用2支，分17组 （6、6、5） 标准品粉末20EU/支，用1ml水溶解涡旋15min，配制 成20EU/ml储存液，λ 0.25EU/ ml ，预实验4 λ成凝 胶，工作液为1EU/ml 每班：50 μl标准品用1m水稀释 每组2支鲎试剂干粉、每班12支 每组0.3ml检测用水、每班1.8ml，给1支 （2ml/支） 每组0.1ml标准品工作液、每班给1ml