蛋白质和酶工程酶提取、分离和纯化.pptVIP

一、概述 二、酶的提取 三、酶的分离纯化 四、酶的结晶 五、浓缩与干燥 六、酶纯化步骤的设计及评价 一、概述 1-1 酶提取与分离纯化的定义 将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与其它物质分开，从而获得所需酶的技术过程 *酶的纯化程度根据需要而定 *纯化方法多种多样，为获得较好的效果往往是2种或2种以上联合应用 1-2 提取纯化之目的 1)酶催化功能的应用 2)酶学研究 酶的结构、功能、催化机制、催化动力学 酶的生物合成及其调控规律等 1-3 纯化的必要性 1)生物细胞中同时存在多种多样的酶 2)多酶可能作用于同一个底物 3)酶在生物细胞中的分布并不是均一的 二、酶的提取（extraction) 2-1 了解所分离酶在细胞中的分布 1、细胞外酶：由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶；大多属于水解酶，通常含量高，容易得到 2、细胞内酶：在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用。该类酶在细胞内往往与细胞器结合，不仅有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序性 真核细胞内酶的分布 ①细胞膜：ATP酶、腺苷酸环化酶等 ②细胞核：DNA聚合酶、连接酶和RNA聚合酶等 ③线粒体：三羧酸循环、电子传递、氧化磷酸化、尿素循环、脂肪酸氧化、脂肪酸合成酶以及蛋白质合成、DNA聚合酶、RNA聚合酶等 ④高尔基体：多糖、核蛋白粘液生成酶 ⑤溶酶体：各种水解酶等 ⑥叶绿体：参与光合作用形成ATP、NADPH有关的酶类、与暗反应有关的酶系 2-2 起始材料的选择 原则：选取酶含量高的材料 可以是天然的动植物 或人工培养的微生物、动植物细胞等 *注意材料的生长阶段 *注意酶在生物体内的富集区域 由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料和成本的限制，因此，目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂 2-3 细胞膜和细胞壁的破碎 1、主要方法： 2、选择原则 2-4 酶的提取 1、定义 在适当条件下，用适当的提取液处理含酶原料，使酶充分溶于其中的过程。 2、提取液的选择 根据酶的结构和溶解特性来选择适当的提取液 *极性物质易溶解于极性溶剂，反之，即相似相溶 *酸性物质易溶解于碱性溶液，反之亦然。 2-4 酶的提取 3、常用的提取液：酶通常都溶于水，因此通常用水作为溶剂，配制成一定浓度的稀酸、稀碱、稀盐溶液进行抽提 4、有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂抽提，如：丙酮粉，有助于酶与脂肪或磷脂膜分离； 高离子强度水溶液也有助于酶从结合的膜上解析下来。 2-5 主要的提取方法 1、盐溶液提取 该法用于在低浓度盐溶液中溶解度大的酶的提取 常用的盐浓度：0.02-0.05mol/L，大多数P酶用该 法提取 R酶常用0.14mol/L的NaCl溶液提取。 *盐溶现象：低盐条件下，酶在水中的溶解度随盐浓度升高而增加的现象 *盐析现象：当盐浓度达到一定界限后，酶的溶解度则随盐浓度升高而降低的现象 2、酸溶液提取 在酸性条件下溶解度大并稳定的酶可用此法 如：胰蛋白酶（pI=8.9）可用0.12mol/L的硫酸溶液 3、碱溶液提取 在碱性条件下溶解度大并稳定的酶该法适用 如：大肠埃希菌的L-天冬酰胺酶（pI=4.85）可用pH11-12.5的溶液 4、有机溶剂提取：如酶与脂质结合牢固，或含有较多非极性基团的酶，可用与水混溶的有机溶剂（乙醇、丙酮、丁醇等），如： P酶：胆碱酯酶、细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶等用丁醇萃取，有较好效果 R酶：可用酸苯酚溶液提取 主要的提取方法小结 5、影响酶提取的其它重要因素 温度：适当提高，可以提高酶的溶解度和酶分子的扩散速度；过高则引起酶失活 pH: 在等电点条件下，酶的溶解度最小；为提高溶解度，要避开酶的等电点;但是，也不宜偏离pI太远（过高或过低），以免引起酶变性失活 提取液体积 *适当增加其体积，可以提高酶的产率 *过量，则降低[酶]，增加后续分离纯化的难度 一般为原始材料的3-5倍，且分3次使用 加入保护剂，以提高酶的稳定性 如酶的底物、辅酶和某些抗氧化剂 三、酶的分离纯化（isolation,separation) ( purification) 3-1 分离纯化方法分类 1、基于分子大小或质量 (1)离心 (2)透析 (3)凝胶过滤 (4)超过滤 2