常见《分子生物学》实验.docxVIP

溶液稀释与配比 C1V讦C2V2：万能稀释公式，一般母液和终浓度比不为X:1用这个公式计算。X/1：当 母液与终浓度比为X： 1吋用这个快速方法，此吋方法为把母液分为1,剩下的用总比例减 掉,如:X2 (1:1), X6 (1:5), X10 (1:9)。 百分数和mol数转以1%盐浓度进行转换 换设是100克的此溶液，则有99克的水和1克的盐(NaCI),盐的物质的量为 l/58.5=0.017mol,水体积为 99mL=0.099L,所以物质的量浓度为 0.017/0.099=0.17 mol/L, 即摩尔浓度为0.17mol/L l%=lg/100 g (1/58.5)/0.09 9 CTAB法提取DN A 各成分作用 CTAB：溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； Tris-HCI (pH8.0)：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA：螯合Mg2+或Mn2 +离子,抑制DNas e活性; NaCI：提供一个高盐坏境，使DNA充分溶解，在于液相中； B ?蔬基乙醇：抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醍，避免褐变，使酚容易去除； pv P(聚乙烯毗咯烷酮)：酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除 多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 酚：使蛋白质变性，同时抑制了 DNa se的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白 与DNA联结键己断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚 相，而DNA溶于水相。 氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚。 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减 少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白 相及下层有机溶剂相维持稳定。 操作步骤 打样 新鲜叶片，转速220r/min, lmin,打样吋管身全部冻着，而且放在打样机的吋候保证 盒子里面得有液氮，这样样品才能充分打碎，写字的朝向一致，以便认字 提取 称取O.lg(约3 -4片)新鲜叶片，液氮屮研磨成粉末，加入800UICTAB缓冲液轻轻摇 匀，65° C水浴(烘箱)保温3 0min左右； 备注 用2ml管提取时，加完CTAB在本子上记录好每个样品的名字，防止后面漏管和裂 管时查找被抹掉的号，这样可以防止在侧壁写管的麻烦； 在等待的过程时，即可拿出1.5ml离心管加入异戊醇做好准备；写字的朝向一致， 以便认字 2?冷却(放冰箱)至室温后，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)盖上瓶盖，温和摇动, 使成乳状液。 备注 一定要冷却，不然的话，热涨后盖子盖不紧， 此处必须摇匀，不然会因为分层不明显，表面容易起一层油状层； (按照管盖的的朝向,在加完异戊醇的管上写上对应样品名字，字迹要大,以防相 同的数字出现如81/18 ,以及即使掉了一些也还有一部分可以识别) 8000rpm 10 min，离心管屮岀现三层，小心吸取含有DNA的上清液(40 0-500ul)到 新的1.5ml离心管中。根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇重复抽提次； 备注 吸上清液时，按照前面写好的顺序，打开盖，同时打开异丙醇的盖，可以检查哪些漏 掉，一旦发现漏掉的，立马盖上盖子，吸完别的后平躺着吸这管 吸上清时，枪头不要挨着最深处的上清液，挨着上面那个片层处吸，能吸多少吸多少 在上清液中，加入0.7倍/等体积的异丙醇(400-500UI ),颠倒混匀，放?2 0入冰箱 不少于20m in； 备注：倒废液时，用空板一排一排倒 8 OOOrpm离心2 Omin,弃上清；力D600ul的70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟， 8000rpm离心5min,除去乙醇，即为DNA粗制品； 备注：倒扣在卫生纸上，可以干得更快，4 0min左右即可拿出，迅速加水溶解， 37 摇床,67r, lh 注意事项 吸取上清液时一定要小心，必要时减掉枪头顶端； 在倒废液时，找一个管架，盖子打开后朝里侧将其尽量合拢，管口朝外，扣住管架 后，一起倒掉废液，这样可以避免液体毁掉管上的字； 在盖盖吋，拇指按住盖，找進方向按下去； 碱煮法提DN A 试剂 O.lmoL/LNaOH： 4g NaOH,定容至 IL 1XTE (lOmMTris-HCI, pH 8.0； 1 m M EDTA, pH 8.0 )组分 1 M Tris-HCI (pH 8.0) 50 ml的配制：称取T ris碱6.06 g ,加超纯水40 ml溶解,滴 加浓HCI约2 ml调pH至0,定容至50 ml。 0.5 M EDTA (pH 8.0) 5 0 ml 的配制：称取EDTA-Na2 ? 2 H20,9.306 g,加超纯水 35 m I,剧烈搅拌，用约1 .2g NaOH颗粒调pH