酶联免疫吸附试验(ELISA).pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * Competitive ELISA A third use of ELISA is through competitive binding. The steps for this ELISA are somewhat different than the first two examples: Unlabeled antibody is incubated in the presence of its antigen. These bound antibody/antigen complexes are then added to an antigen coated well. The plate is washed, so that unbound antibody is removed. (The more antigen in the sample, the less antibody will be able to bind to the antigen in the well, hence competition.) The secondary antibody, specific to the primary antibody is added. This second antibody is coupled to the enzyme. A substrate is added, and remaining enzymes elicit a chromogenic or fluorescent signal. ELISA实验过程 1. 实验试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。 ELISA实验中应用蒸馏水或去离子水，自配的缓冲液的PH应用pH计进行较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 2. 加样 在ELISA实验中一般有5次加样步聚，即加标准品、加样本、加酶标记物、加底物、加反应终止液。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。　　加样时一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。 3. 保温 　 在ELISA中一般加标本和加酶标记物后会有一次抗原抗体反应。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)。 ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。　　 温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。 为了便于操作目前绝大部分的试剂盒均采用室温进行温育反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。 4. 洗涤 　 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。 聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。　　 洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作主要为浸泡式，过程如下： a.吸干或甩干孔内反应液； b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）； c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短； d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干； e.重复操作c和d，洗涤3-4次（或按说明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。 5. 显色和比色