细胞培养基本的技术.ppt

5、培养细胞不贴壁 胰蛋白酶消化过度 缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度 支原体污染 分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物 培养液中无贴壁因子 6、欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？ 欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡 8、培养液pH 值变化太快 CO2 张力不对 按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度，2.0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3 对应CO2 浓度为5％ 到10％ 改用不依赖CO2 培养液 培养瓶盖拧得太紧 松开瓶盖1/4 圈 NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足 加HEPES 缓冲液至10 到25mM 终浓度 培养液中盐浓度不正确 在CO2 培养环境中改用基于Earle′s 盐制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液 细菌、酵母或真菌污染 丢弃培养物或用抗生素除菌 9、培养液出现沉淀，但pH值不变 用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来 用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌 冰冻保存培养液 将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液 10、培养液出现沉淀，同时pH 发生变化 细菌或真菌污染 丢弃培养物 抗生素除菌 11、原代细胞培养物污染 原代培养组织在进入培养前已污染 培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织 12、支原体(mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？ 不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。 如有支原体污染，直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 培养细胞活力测定 细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。? 任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。 1. 细胞克隆形成率实验： 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成卒用来表示细胞的增殖能力。 克隆形成率比＝克隆形成数／接种细胞数 缺点：操作繁琐 优点：精确、可靠 2.台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占 细胞中的百分比表示细胞恬力 已淘汰 3. 四唑盐（MTT）比色法四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝， 四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值 MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。 操作步骤 （1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％ CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间） （2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时。 （3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。 （4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制 3. MTT法(3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐)  原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物(formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。DMSO能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比，再用酶标仪测定OD值 MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。 操作步骤 a.100μL单细胞悬液接种于96孔板(5×104)。 b.培养24h后，加药，设六个平行样。 c.给药72h后，加入0.5mg/mL的MTT液(50μL)；继续培养4h。 d.吸出孔内培养液后，加入DMSO(200μL)，然后微孔板扳荡器上振荡10分钟。 e.酶标仪检测各孔OD值(检测波长570nm) 抑制率=(1-给药组平均OD/对照组平均OD)×100% 实验结果： 剂量 细胞抑制率(%) 　(μg/mL) SGC-7901 HepG-2 1 -15.2 -19.9 50