单分子分析单分子检测原理.pptVIP

如何实现??? 通过降低体系的浓度(密度)和缩小探测体积可达 到这两点要求. 这里给出一个简单的计算例子:假设探测体积为1fL(10-15L),分析浓度为0.1nmol/L,则探测区内所含分析物的量为10-25mol,即平均含0.06个分子. 这意味着大部分时刻没有分子在探测区,偶尔一个分子扩散进入探测区. 单分子检测方法 荧光相关光谱 - 自相关曲线(auto-correlation curve) 荧光相关光谱-浓度测量 (Eigen, PNAS, 1994, 5740;Schwille, Biophys.J. 1997,1878) TheVeff can be easily obtained from calibration experiment, and G(0) can be read out from the auto-correlation curve. 单碱基对之间的力(Nanoletters,2003,3,493-496) 微悬臂的扭转弯曲程度随表面摩擦特性变化而增减（增加摩擦力导致更大的扭转）。激光检测器可以实时分别测量并记录形貌和横向力数据。 原子力显微镜-侧向力模式 通常不仅样品表面组分不同可以导致微悬臂扭曲，样品表面形貌的变化也会导致微悬臂的扭曲， 为了区分这二者，通常LFM图像和AFM图像应该同时获得。根据导致微悬臂扭曲的原因不同，通常可以利用LFM获得物质表面的组分构成像和“边缘增强像”。 原子力显微镜 原子力显微镜常用的样品基底 ①.云母 ②.金表面 ③.硅表面 ④石墨(HOPG) 原子力显微镜针尖的扫描电镜图(SEM) 原子力显微镜研究药物分子与DNA的相互作用 (PNAS,1996,12283-12286) DNA吸附在石墨表面的原子力成像 (Langmuir,2003,) DNA与蛋白质激酶的相互作用 原子力显微镜研究DNA凝聚 (Biochemistry,1999,38,14069-14076) 原子力显微镜成像获得ＤＮＡ转录的中间体 （PNAS,2001,98,8454-8460.) ?-CD与二茂铁的相互作用的单分子力 (Langmuir,2002,18,6988-6994.) 双螺旋DNA单分子的测定(PNAS,1999,96, 11277-11282) * * 第4章 单分子分析 单分子检测原理 在凝聚态,一个分子的荧光辐射通常按以下四个步骤循环 发生: ①.电子基态向电子激发态的跃迁,其速率与激发光功率 成线性关系; ②.电子激发态的内弛豫; ③.由电子激发态向电子基态的辐射或非辐射跃迁,其速 率与激发态寿命有关; ④.电子基态的内弛豫. 对于凝聚相中的小分子,振动和转动弛豫发生在皮秒 量级上,而吸收时间和激发态寿命发生在亚纳秒至纳秒量 级.因而,吸收周期主要由吸收和发射步骤决定. 当一个分子退激回到基态时,分子处于新一轮激发和发 射的状态.这种一个分子反复激发而发射出大量光子的现 象被称为?光子爆发?. 在理想情况下,一个分子大约能辐射出105-106个荧光光 子.如罗丹明6G在乙醇溶液中可辐射1.7×106个光子. 单分子检测原理 ①.在被照射的体积中只有一个分子与激光发生 相互作用; ②.确保单分子的信号大于背景干扰信号. 对单分子荧光的探测必须满足两个基本要求: 单分子荧光的判断标准: ①.检测到的荧光信号出现的频率或数目必须与分析物 的浓度成线性关系,而信号的强度不变; ②.光漂白要么完全发生,要么完全不发生,不存在中间 模式; ③.由于分子所处环境的扰动,不同分子的光谱,不同时 间的光谱是变化的; ④.信号依赖于激发强度,对单个分子而言会出现饱和; ⑤.检测到的荧光数目不能超过单个分子在一个荧光周 期内所能发射的光子数. ⑥.由于分子之间是彼此分离的,荧光信号与时间的关系 应该呈现出反群聚性. 单个ＤＮＡ分子的荧光光漂白 A.单个?-DNA/Ru(phen)2dppx2+的荧光 B.单个?-DNA/Ru(phen)2dppx2+的荧光的光漂白 A.单个?-DNA/Ru(phen)2dppx2+的荧光光漂白; B.A+巯基乙醇; C.A+巯基十一酸 单个ＤＮＡ分子的荧光光漂白的抑制 单分子荧光特征 单分子荧光的典型特征是量子跳跃现象,既会形成一 个发射-暗态交替的量子跃迁过程,这一重要特征导致了实 验中观察到的单分子荧光光谱和荧光强度的波动现象. 单分子的荧光强度随时间的变化 单分子荧光特征 单分子荧光的另一重要特征是其偏振特性.单个荧 光分子具有其唯一的固有荧光和吸收跃迁偶极矩,分子 只吸收