Caco2细胞单层模型探究黄芩提取物中黄芩苷转运机制和白芷提取物对其转运影响.docxVIP

Caco—2细胞单层模型探究黄苓提取物中黄 苓昔转运机制和白芷提取物对其转运影响 ［摘要］目的：研究黄苓提取物中黄苓昔的吸收转 运机制以及白芷提取物对其吸收影响，分析探讨白芷提取物 对黄苓昔转运的影响机制。 方法：建立人源结肠腺癌细胞系Caco-2细胞模型，利 用此模型研究pH、时间、药物浓度、温度对黄苓提取物中黄 苓昔的转运影响；研究黄苓昔在P-gp, MRP蛋白专属抑制 剂存在与否时黄苓昔在Caco-2细胞模型的双向转运情况； 并考察白芷提取物对黄苓昔吸收转运的影响。 结果：37 9环境下黄苓昔转运在pH 7. 4条件下吸收较 好，且存在浓度依赖性；4 °C环境下蛋白失活，转运量降低; 黄苓昔双向转运PDR为0. 54, P-gp抑制剂维拉帕米、MRP抑 制剂丙磺舒加入后，黄苓昔BL-AP转运减少，而PDR无差 异。加入白芷活性成分香豆素、挥发油、香豆素与挥发油混 合物后黄苓昔转运分别提高了 2. 34, 3.31, 3. 13倍。 结论：黄苓昔主要转运机制为被动转运，兼有外排蛋白 参与。白芷活性成分对黄苓昔有促吸收作用，此作用可能与 黄苓昔的被动转运机制有关，白芷提取物打开了细胞间的紧 密连接，也可能与白芷抑制外排蛋白的表达或功能有关。 ［关键词］Caco-2细胞模型；白芷提取物；黄苓昔；转 运机制；P-gp； MRP 黄苓昔作为黄苓主要有效成分，也是黄苓及其制剂中主 要的质量指标，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗致癌等作用 ,此外，研究表明黄苓昔在外周多种组织器官具有抗炎、 抗血栓、扩血管及解热等多种药理作用[2-3] o同时，黄苓 昔是一个难吸收药物[4],导致其较低的生物利用度。白芷- 黄苓为常用药对，有报道挥发油具有促吸收作用，香豆素可 以抑制代谢酶活性[5],白芷主要成分为香豆素与挥发油， 但有关黄苓提取物中黄苓昔的吸收机制研究较少。本文首先 利用人源结肠腺癌Caco-2细胞单层模型研究黄苓昔的吸收 机制，考察黄苓昔吸收过程中可能遇到的肠道屏障，同时利 用Caco-2细胞模型验证白芷活性成分对黄苓昔促吸收作用, 探讨白芷提取物促进黄苓昔转运吸收的可能机制，有助于阐 明白芷-黄苓药对的配伍原理。 1材料 Forma3111二氧化碳培养箱（Thermo）； TS1OO-F倒置显 微镜（Nikon）； HHS型电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限 公司）；TDZ4A-WS低速台式离心机（长沙湘仪离心机）；高速 冷冻离心机（德国，SIGMA公司）；QYC-Z00恒温摇床（上海 福玛实验设备有限公司）；Agilent 1200高效液相色谱仪（安 捷伦科技有限公司）；Millicell-ERS电阻仪（Millipore, USA）； 24孔培养版（Costor）； SZ-97自动三重纯水蒸馆器 （上海亚东生化仪器厂）。 DMSO、环鞄菌素A （批号C8780）购自北京Solarbio科 技有限公司；黄苓昔对照品（批号101765-200408）购自中 国食品药品检定研究院；黄苓提取物（以黄苓昔计含量为 160. 98 mg ?旷1生药）、白芷挥发油（提取率2.0%, a-菠 烯质量分数为6.71%.甲基环癸烷7.4%、正十四烷醇3. 80%） 和白芷香豆素（总香豆素含量为50%）均为自制；盐酸维拉 帕米和MK-571 （批号11711）购自美国Sigma公司；丙磺舒 （北京燕京药业有限公司提供）；甲醇（色谱纯，德国Merck 公司）；磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；双蒸 水。 2方法 1色谱条件 Phenomenex Luna5u C18 色谱柱（4. 6 mmX250 mm, 5 u m）, 流动相为乙睛水溶液-0.2%磷酸水溶液24 : 76,等度洗脱， 检测波长为280 nm,柱温为25 °C,体积流量为1 mL ? min - 1, 进样量为20 uLo 2. 2 Caco-2细胞模型的建立 Caco-2细胞培养于37 °C, 5%C02的环境中，采用DMEM 培养基，其中含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰 胺以及青霉素-链霉素双抗液。隔天换1次培养液，每4天 按1 ： 3的比例传代。将对数生长期细胞按1X105 mL-1接 种到24孔培养板上，接种后隔天换液，7 d后每日换液， 培养至21 do参照文献方法[6],检测碱性磷酸酶活性和各 孔跨膜电阻（跨膜电阻大于500 Q?cm-2）,选择Caco-2细 胞单层生长状态完好、符合转运条件的M订licell膜用于 转运实验。实验前，用37匸空白Hank s缓冲盐溶液（HBSS 溶液，pH 7.4）清洗细胞单层2次，之后放入5%C02, 37 °C 培养箱内培养30 min。 2.3提取物的制备 白芷香豆素：取200 g白芷，加8倍量75%乙醇回流提