胃蛋白酶效价测定实验方案.docVIP

胃蛋白酶 检验用试剂: 盐酸、酪氨酸、胃蛋白酶、三氯醋酸、牛血红蛋白 酪氨酸烘干至恒重（105℃）、试管（16支/组，至少12支/组，最少8支试管） 试液的配制： 1mol/L盐酸溶液：90ml盐酸，加水稀释并定容至1000ml。（配500ml） 盐酸溶液：取1mol/L盐酸溶液65ml，加水至1000ml。（每组各配1000ml） 5%三氯醋酸溶液：配600ml 血红蛋白试液：配600ml （每组至少20ml） 血红蛋白试验 取牛血红蛋白1g，加盐酸溶液(取1mol/L盐酸溶液65ml,加水至1000ml)使溶解成100ml，即得。本液置冰箱中保存，2日内使用。 对照品 供试品 供试品的空白对照 对照品的空白对照 试管编号 1、2、3 4、5、6 7 8 对照品溶液 1.0ml 供试品溶液 1.0ml 水浴保温 37℃±0.5℃水浴中，保温5 分钟 预热的血红蛋白试液 加入预热至37℃±0.5℃的血红蛋白试液5ml ，摇匀，在37℃±0.5℃水浴中反应10分钟 加入5%三氯醋酸溶液5ml摇匀 供试品溶液1ml 盐酸溶液1ml 摇匀，滤过，取续滤液备用 275nm 的波长处测定吸收度 本品系自猪、羊或牛的胃黏膜中提取的胃蛋白酶。每1g中含蛋白酶活力不得少于3800单位。 【效价测定】对照品溶液的制备　 精密称取经 105℃干燥至恒重的酪氨酸适量，加盐酸溶液〔取1mol/L盐酸溶液65ml，加水至1000ml 〕制成每1ml 中含0.5mg 的溶液。 供试品溶液的制备 取本品适量，精密称定，用上述盐酸溶液制成每1ml 中约含 0.2～0.4单位的溶液。 测定法　 取试管6 支，其中3 支各精密加入对照品溶液1ml ，另3 支各精密加入供试品溶液1ml ，置37℃±0.5℃水浴中，保温5 分钟，精密加入预热至37℃±0.5℃的血红蛋白试液5ml ，摇匀，并准确计时，在37℃±0.5℃水浴中反应10分钟。立即精密加入5%三氯醋酸溶液5ml ，摇匀，滤过，取续滤液备用。另取试管2 支，各精密加入血红蛋白试液5ml ，置37℃±0.5℃水浴中保湿10分钟，再精密加入 5％三氯醋酸溶液5ml ，其中1支加供试品溶液1ml ，另1 支加上述盐酸溶液1ml ，摇匀，滤过，取续滤液，分别作为供试品和对照品的空白对照，照分光光度法（附录Ⅳ A）在275nm 的波长处测定吸收度，算出平均值ＡS和Ａ，按下式计算。  Ａ×Ｗｓ×ｎ 每1g含蛋白酶活力(单位)＝─────────────  Ａs ×Ｗ×10×181.19 式中 ＡS 为对照品的平均吸收度； Ａ为供试品的平均吸收度； Ｗs 为对照品溶液每1ml中含酪氨酸的量，μg； Ｗ为供试品取样量，g； ｎ为供试品稀释倍数。 在上述条件下，每分钟能催化水解血红蛋白生成1μmol 酪氨酸的酶量，为一个蛋白酶活力单位。