蛋白质纯化技术 - Lite.pptxVIP

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蛋白质的分离纯化与鉴定 Isolation, Purification and Identification of Protein;分子生物学圣经—分子克隆实验指南;为什么要纯化蛋白质?;蛋白质工程中进行蛋白质纯化的必要性;本章概要;一、蛋白纯化方法;1.与蛋白质分离纯化相关的理化特性;1.1分子大小; 透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。; 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜,达到浓缩蛋白质溶液的目的。; 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜,达到浓缩蛋白质溶液的目的。;凝胶过滤;超速离心 ;超速离心 ;1.2分子形状;1.3电荷;1.4溶解度;蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出,称为盐析。 盐析原理: 高浓度盐离子破坏蛋白质分子表面的水化膜,影响蛋白质分子表面所带电荷,从而引起蛋白质沉淀,但通常不会引起蛋白质的变性。;1.5配体特异性结合;1.6吸附性质;1.7变性和复性;2. 分离方法;*不可能有一套统一的方法适用于分离纯化所有的蛋白质, *但每一种蛋白质可能都有一套适合的分离纯化程序, *而且所用的主要技术手段都基本相同。;二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤;二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤;蛋白质纯化的前期准备 ;1、选择实验材料及预处理;材料破碎;2、蛋白质的提取;2、蛋白质的提取;3、蛋白质的粗分级(粗提);4、蛋白质的细分级;4.1. 层析( chromatography );凝胶介质; 层析装置(Chromatographic equipment);①;4.1. 层析( chromatography );4.1.1 分子筛层析 (Gel filtration);分子筛层析 Gel filtration chromatography;分子筛层析 Gel filtration chromatography;分子筛层析 Gel filtration chromatography;分子筛层析 Gel filtration chromatography;4.1.2 离子交换层析( Ion exchange );4.1.2 离子交换层析( Ion exchange );离子交换层析( Ion exchange );4.1.3 亲和层析(Affinity chromatography);亲和层析(Affinity chromatography);His-亲合示意图(金属螯合层析);4.1.4 疏水作用层析;4.2.电泳( Electrophoresis );蛋白质常用电泳技术;4.2.1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳;电泳法测目标蛋白的分子量;4.2.2不连续PAGE分离蛋白质的原理;4.2.3 等电聚焦电泳(Isoelectric focusing—IEF);等电聚焦(Isoelectric focusing);4.2.4 双向电泳;①Isoelectric focusing;Two Dimensional Electrophoresis of E. coli Proteins;蛋白质纯化策略 方案设计篇 ?Protein purification strategy;三、纯化方案设计原则;确定纯化目标;三、纯化方案设计原则;三、纯化方案设计原则;严格依据目标蛋白质的特殊生物学性质,来设计活性检测方案 常见检测方法: 酶学检测 enzymatic assays. 配体检测 ligand-binding assays 免疫检测 immunological assays;三、纯化方案设计原则;尽量减少纯化步骤;减少每步操作时间 to avoid lengthy procedures which risk losing activity/reducing recovery 减少添加物 additives may need to be removed in an extra purification step or may interfere with activity assays 早期除去降解物(如蛋白酶) for example, proteases 每步使用不同的纯化方法 to take advantage of sample characteristics which can be used for separation (size, charge, hydrophobicity, ligand specificity);四、蛋白质的鉴定;1 浓度测定;1 浓度测定;1 浓度测定;2. 纯度鉴定;色谱纯;纯度实验反面例子:;3.蛋白质的特性测定;3.1蛋白质分子质量及等电点的测定;3.2氨基酸组成及序列分析;3.3

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