棉铃虫polycalin基因的克隆、mrna表达特性及功能分析-农业昆虫与害虫防治专业论文.docxVIP

研究生优秀毕业论文 棉铃虫Polycalin基因的克隆、mRNA表达特性及功能分析目 棉铃虫Polycalin基因的克隆、mRNA表达特性及功能分析 目 录 摘 要 ．i Abstract iii 第一章 绪论 l 1．1转基因作物的应用 l 1．2苏云金芽孢杆菌6一内毒素的结构及功能 ．2 1．3靶标害虫抗性机制 一7 1．4害虫抗性治理策略 ．10 1．5研究内容，目的意义和技术路线 ．10 第二章基因克隆 ．12 2．1材料与方法 一12 2．2结果与分析 ．20 2．3讨j沦 ．．23 第三章Polycalin基因在棉铃虫不同发育阶段及不同组织中的表达谱分析 一24 3．1材料与方法 ．24 3．2结果与分析 26 3．3讨论 ．．27 第四章棉铃虫取食CrylAc蛋白后中肠Polycalin的表达量变化 28 4．1材料与方法 28 4．2实验结果 28 4．3讨论 一29 第五章Polycalin原核表达及功能分析 3 1 5．1材料与方法 3 1 5．2结果与分析 37 5．3讨论 ．．42 第六章抗性品系棉铃虫Polycalin基因的变化 44 6．1实验材料与方法 44 万方数据 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文6．2实验结果 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文 6．2实验结果 46 6．3讨论 一50 第七章全文总结 ．53 7．1结论 ．53 7．2问题与展望 54 参考文献 55 万方数据 棉铃虫Polycalin基因的克隆、mRNA表达特性及功能分析摘要 棉铃虫Polycalin基因的克隆、mRNA表达特性及功能分析 摘要 由Bt(Bacillus thuringiensis)产生的Cry蛋白引起昆虫死亡的过程中，Cry蛋白 与昆虫中肠受体蛋白的结合起着至关重要的作用，结合能力的下降或丧失将导致昆 虫对Cry蛋白抗性的产生。已有报道表明Polycalin是昆虫中肠上CrylAc的结合蛋 白，本文在棉铃虫Polycalin基因的克隆、mRNA表达谱分析及其功能方面进行了研 究。通过PCR结合RACE技术克隆获得了棉铃虫Polyealin基因的全长序列；利用 实时荧光定量PCR技术测定了在棉铃虫不同发育时期、幼虫肠道不同部位的 Polycalin基因表达量；比较了棉铃虫取食含CrylAc蛋白的饲料后，Polycalin基因 表达量的变化；利用原核表达的方法表达Polycalin的部分片段，合成抗体后，通过 western blot和ligand blot的方法检测了Polycalin蛋白与CrylAc的结合特性；运用 PCR扩增、荧光定量和iTRAQ的方法，比较了抗性和敏感棉铃虫Polycalin在基因 序列、mRNA表达量、蛋白表达量方面的差异。主要结果如下： 1．通过PCR结合RACE技术克隆获得了棉铃虫Polycalin基因的全长序列，该 基因全长序列为2955bp，开放阅读框为2781bp，编码926个氨基酸(GenBank登 录号为KPl00652)；预测蛋白的分子量为101．68KD，等电点为4．57。推导的氨基酸 序列中，N末端含有20个氨基酸组成的信号肽，含有8个O一糖基化位点，3个N． 糖基化位点，C末端存在2个GPI结合位点。 2．Polycalin在棉铃虫所有发育阶段都可以表达，幼虫期表达量较高，尤其在1．3 龄幼虫体内表达量最高，在卵、成虫和蛹中的表达量较低。棉铃虫四龄幼虫取食含 活化CrylAc蛋白的人工饲料后，Polycalin基因的表达受到抑制。 3．通过原核表达Polycalin的部分片段，合成抗体后，通过western blot和ligand blot的方法检测了Polycalin蛋白与CrylAc的结合特性。抗性及敏感棉铃虫品系 Polycalin基因序列在编码区核苷酸水平上存在4个突变，但是在氨基酸水平上没有 差异；抗性品系4龄棉铃虫幼虫Polycalin基因的表达量极显著高于敏感品系，敏感 品系棉铃虫2龄幼虫及成虫中Polycalin基因的表达量都显著高于抗性品系。Western blot及iTRAQ实验结果表明，Polycalin蛋白在抗性品系中的表达量都比较高。 万方数据 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文以上结果说明棉铃虫Polycalin是CrylAc的结合蛋白，并且在抗性品系中 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文 以上结果说明棉铃虫Polycalin是CrylAc的结合蛋白，并且在抗性品系中 Polycalin的蛋白的表达量升高。Polycalin基因是否在棉铃虫的抗性演化中是否发挥 作用还需要进一步的验证。 关键词：棉铃虫：Polycalin基因：表达；Bt：抗性 万方数据 棉铃虫Polycalin基因的克隆、mRNA表达特性