组蛋白修饰在亚酸钠抑制细胞双链断裂修复中的作用.docVIP

组蛋白修饰在亚砷酸钠抑制细胞双链断裂修复中的作用 章征保 李道传 牛林梅 陈雯* 中山大学公共卫生学院预防医学系 Email：chenwen@mail.sysu.edu.cn 目的： 组蛋白修饰是表观遗传学的重要调控模式之一，可以通过改变染色质的空间构象参与众多细胞生理病理过程。组蛋白异常修饰与DNA损伤修复缺陷，细胞周期失调，细胞转化等过程密切相关。本实验室发现亚砷酸钠具有抑制DNA双链断裂（DNA double-strand repair，DSB）修复的能力。本研究目的在于筛选出参与亚砷酸钠抑制DSB修复过程的组蛋白H3甲基化和乙酰化修饰位点并初步探讨组蛋白修饰参与DSB修复的机制。材料和方法：用0.1μM，0.25μM，0.5μM和1μM的亚砷酸钠处理16HBE细胞24h，检测处理组中组蛋白H3乙酰化和甲基化位点修饰的变化情况及相应的组蛋白修饰酶的改变。进行不同剂量亚砷酸钠处理细胞24h后，使用喜树碱（CPT）处理16HBE 2h后撤掉药物，通过检测γH2AX的恢复时间检测砷处理对于细胞的DSB损伤修复效应。利用不同剂量的亚砷酸钠染毒处理DSB修复检测系统：非同源末端重组修复能力检测细胞株140C和同源重组修复能力检测细胞株97A，明确亚砷酸钠抑制DSB修复的类型。选取砷染毒后差异修饰位点，用逆转录病毒感染方法在16HBE细胞中对这些位点进行突变并敲除特异性修饰酶，建立特定位点修饰缺陷的细胞模型，并进行γH2AX的恢复时间试验和DSB修复能力检测，明确特定位点修饰对于DSB修复的影响。结果：本研究发现本研究发现亚砷酸钠处理16HBE细胞可以引起H3K4me2，H3K9me3的明显升高，并能引起相应修饰酶NSD3和SUV39H1的表达改变。亚砷酸钠的处理可以引起16HBE细胞CPT处理后γH2AX的恢复时间延长，表明砷可以影响细胞DSB的损伤修复过程。DSB修复能力检测发现砷染毒降低了细胞HR的修复能力，表明砷可能通过影响HR通路抑制DSB修复过程。在16HBE细胞中构建了H3K4和H3K9突变细胞株分别为16HBE-H3K4A和16HBE-H3K9A，并检测发现2个突变细胞中H3K4me2和H3K9me3出现明显的下降，而相应的乙酰化修饰H3K4ac和H3K9ac在突变株中并未受到影响；同时在16HBE中构建了H3K4me2和H3K9me3的主要甲基修饰酶NSD3和SUV39H1的敲除细胞模型16HBE-siNSD3与16HBE-siSUV39H1，通过检测相应的H3K4me2和H3K9me3修饰验证敲除模型构建成功。γH2AX的恢复时间试验检测组蛋白修饰缺陷细胞株结果发现16HBE-H3K9A与16HBE-siSUV39H1的γH2AX的恢复时间与对照细胞相比均升高并且DSB修复能力检测显示他们均可抑制HR修复过程。结论：组蛋白修饰参与亚砷酸钠抑制细胞DSB修复过程。亚砷酸钠可以通过促进组蛋白修饰酶SUV39H1的表达提高细胞整体的H3K9me3修饰水平，从而抑制细胞HR的修复能力。