乙型肝炎病毒基因分型与TaqMan-MGB荧光探针方法改进.docVIP

PAGE PAGE 1 乙型肝炎病毒基因分型与TaqMan-MGB荧光探针方法改进 郑卫东1， 胡菊2? （1.湖北医药学院附属人民医院检验部，湖北十堰442000 2.十堰职业技术学院生化和环境工程系，湖北十堰 442000） [摘要] 目的 改进对乙型肝炎病毒(HBV) S基因TaqMan-MGB型特异性荧光探针设计，使探针序列与非本型靶基因核苷酸靶序列，有2-4碱基不互补，以此提高TaqMan-MGB型荧光探针特异性，建立一种快速准确的实时PCR检测乙型肝炎病毒基因型方法。方法 根据HBV基因型A～H的全序列 ,在S基因区设计引物和型特异性TaqMan-MGB探针,建立实时PCR检测HBV基因型方法，并检测88例CHB患者的 HBV基因型，同时对扩增的PCR产物,进行核苷酸序列测定,应用统计学方法对两者进行比对。结果 CHB血清样本中HBV以基因型B和C为主、基因型A、B、C、B+C、D样本比例分别为2.3%、45.5%、35.2%、12.5%、2.3%，未检测出其它基因型，S基因测序结果与本分型法完全一致。结论　应用改进TaqMan-MGB探针建立的实时荧光PCR HBV基因分型法和目前PCR扩增后测序、限制性内切酶酶切后电泳或核酸杂交相比，更能简便、灵敏、快速、准确地鉴定 HBV基因型。 [关键词] 肝炎病毒；基因型；聚合酶链反应；TaqMan-MGB探针 HBV在复制过程中由于缺乏校对酶的作用容易发生核苷酸配对错误，以致基因突变频繁发生，产生不同的HBV基因型。目前根据HBV核苷酸全序列异质性≥8%或S基因序列核苷酸异质性≥4%，将HBV分为A～H共8个基因型(A～H )。HBV基因型存在典型的地域分布差异。我国 HBV基因型主要为 B和 C型，也存在少量的A和D型，以及这些基因型的混合感染[1] 。目前的HBV基因分型主要是全基因或S基因序列分析，聚合酶链反应，再使用电泳进行限制性片段长度多态性分析，以及使用特异性引物PCR，型特异性探针核酸杂交等方法[2-3] ，这些方法需在PCR扩增后测序、限制性内切酶酶切后电泳或核酸杂交，在临床检验应用中存在准确性和操作烦琐问题，为了避免这些问题，我们对TaqMan-MGB探针设计作了改进，并以此建立的实时荧光PCR检测HBV基因型方法，对CHB患者血清样本中的HBV基因型进行了临床分析。 1 材料与方法 1．1 HBV 基因型A～H PCR引物和荧光探针序列设计和合成 查Genebank,获得HBV 基 因型A～H完全核苷酸序列, Genebank编号分别为：A-AP007263、 AB602818.1、 AB644287.1、 作者简介：郑卫东，男，学士，副主任技师，副教授，统计源以上期刊发表论文10余篇，电话Email: zhengweidong002@163.com. ?通讯作者，Email:HuuJuu@126.com. AB554023.1、AP007262.1、AB166850.1、AB516393.1。依据HBV核苷酸序列确定S 基因核苷酸序列范围: 1—840，并应用DNMAN软件,输入HBV基因型A～H的S基因核苷酸序列,比较序列的同源性,根据比较结果,选择核苷酸序列1-250, 为了使TaqMan-MGB型探针序列与相应靶基因序列，对非本型核苷酸序列有2-4碱基不互补，提高TaqMan-MGB型荧光探针特异性，在核苷酸序列两个区间设计和合成HBV基因型A～H PCR引物和TaqMan-MGB荧光探针，如表1： 表1 HBV 基因型A～H的 PCR引物和TaqMan-MGB荧光探针序列 序号 名称 PCR引物 PCR引物和荧光探针序列 1 HBV-S1 公用上游 5′-cctgctggtggctccagttc-3′ 2 HBV-S2 公用下游 5′-aattg agaga agtcc accac-3′ 3 T-A 基因型A荧光探针 5′- FAM-atattgcctctcac - MGB -3′ 4 T-B 基因型B荧光探针 5′- FAM-agaatactgtctctg - MGB -3′ 5 T-C 基因型C荧光探针 5′- FAM-tactgcctctccta - MGB -3′ 6 T-D 基因型D荧光探针 5′- FAM- cactgcctctccct - MGB -3′ 7 T-E 基因型E荧光探针 5′- FAM-tactgcctcactca - MGB -3′ 8 T-G 基因型G荧光探针 5′- FAM-actattgcctctcac – MGB-3′ 9 HBV-S3 公用上游 5′-gtttgtcctctaattccagga-3′ 10 HBV-S4 公用下游 5′-catcatcttg