TLR4干扰RNA腺病毒的构建及其对肺泡巨噬细胞内毒素-中国急救医学.PDFVIP

·230· TLR4干扰RNA腺病毒的构建及其对肺泡巨噬 细胞内毒素反应的影响 吴飞翔， 吕 欣， 俞卫锋， 黄盛东， 徐学武， 孙玉明， 袁扬， 卞金俊 基金项目：国家自然基金资助项目(No 作者单位：200438上海，解放军第二军医大学东方肝胆外科医院麻醉科(吴飞翔，吕欣，俞卫锋，徐学武，孙玉明)；200433上海，解放 军胸心外科研究所(黄盛东。袁扬)；200433上海，解放军第二军医大学长海医院麻醉科(卞金俊) 通讯作者：俞卫锋(1963一)，男，博士，教授，主任医师，博士生导师，科主任。E—mail：ywI：S08@sohu．corn。 目的构建表达大鼠TLR4 [摘要] siRNA的腺病毒，并观察对内毒素诱导的大鼠肺泡巨噬 细胞，rLR4的抑制和TNF一仅、IL一10释放的影响。方法合成双链寡核苷酸并克隆入pShuttleHl 载体，pShuttleHl一rrLR4线性化后电转化到含pAdEasy—l的BJ5183感受态细菌中获取重组质粒， 重组质粒用脂质体转染293细胞获取重组腺病毒Ad—siTLR4；扩增、纯化腺病毒，TCID50法测定病 毒滴度。原代培养大鼠肺泡巨噬细胞，腺病毒Ad—siTLR4感染后加入内毒素，采用RT—PeR和 Western blot观察TLR4蛋白及mRNA的表达，ELISA检测TNF—o‘、IL一10的释放情况。结果目 的基因序列正确并成功克隆入腺病毒，腺病毒Ad—siTLR4滴度为5．72×109pfu／mL。转染腺病毒 后的内毒素诱导的肺泡巨噬细胞TLR4蛋白和mRNA水平下降，TNF—a、IL一10的表达均明显减 弱。结论本研究成功构建了表达大鼠TLR4siRNA的腺病毒，具有良好的抑制TLR4和TNF—a、 IL一10的作用，为下一步动物体内实验基因治疗急性肺损伤奠定良好的基础。 [关键词】Toll样受体4；RNA干扰；腺病毒；rINF—d；IL—lO [中图分类号】R349．64[文献标识码]A[文章编号]1002—1949(2008)03一0230一晒 Constructionoftheadenovirus rats TLR4siRNAanditseffectonalveolar expressingexpressing reactiontoLPSWU macrophage Fei-xiang。LVXin-YUWei-feng，eta1．DepartmentofAnesthesiolo— Medical 200438。China gY，EasternHepatobiliaryHospital-SecondMilitary University-Shanghai Toconstructthe adenovirus rats [Abstract]Objective incompetent—replicationexpressing TLR4siRNAandto itseffectonalveolar reactionto identify maerophage LPS(Lipopolysaccharide)in vitro．MethodsThe DNA bothsenseandantisenseDNAofthe complementarycontaining Oligo targeting was wastransformedintoE． clonedintothe vector．Lineafized sequence pShuttleHl pShuttleHl一siTLR4 coliBJ5183cells backbone recombinant electr