免疫组化与杂交组化ppt课件.ppt

⑥扩大培养 有两种途径，一是体外培养，其优点是可大量生产，缺点是培养上清液中单抗含量低，仅5-40μg/ml，而且培养液中常含血清，纯化带来麻烦，而且长期培养污染不易控制； 二是体内方法，即在小鼠腹腔接种杂交瘤细胞，方法是先用石蜡油腹腔注射以刺激腹水产生，七天后，在腹腔中接种地107的细胞（细胞密度最好在2×107/ml）。体内方法的优点是单抗的浓度高，可达10mg/ml腹水，还可定期、持续抽取腹水，并不易污染，缺点是一旦小鼠死亡或患病，将一无所得。 ⑶基因工程抗体的特点和制备 基因工程抗体又称重组抗体，它是在充分认识Ig基因结构与功能基础上，应用DNA重组技术和蛋白质工程技术，按照客观需求在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰，重新组装成的新型抗体分子。特点是既保留了天然免疫抗体的特异性和主要生物学活性，并去除或减少了无关结构。 6.抗体的纯化 抗体所在的抗血清、腹水或培养液中，其它成分甚多，如要标记抗体时，必须提纯抗体，以免受杂蛋白的干扰。用不同的方法，可得到不同纯度的抗体：中性盐盐析法只能得到粗的IgG；离子交换层析法（DEAE-52）可得到较纯的IgG组分； 一般来说，抗体试剂的纯度可按以下制剂顺序逐步递增：全血清或腹水-γ球蛋白-IgG（粗提- 细提）-特异性抗体（免疫纯IgG）-特异性抗体片段（Fab或F（ab′）2）。 葡萄球菌蛋白A（SPA）亲和层析法可得到更纯的IgG组分；而用抗原亲和层析柱进行亲和层析或用免疫沉淀法则可得到只针对该抗原的特异性IgG；如再将这特异性的IgG用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶进行酶解，则可得到特异性抗体的Fab段， 葡萄球菌蛋白A（SPA）亲和层析法可得到更纯的IgG组分；而用抗原亲和层析柱进行亲和层析或用免疫沉淀法则可得到只针对该抗原的特异性IgG；如再将这特异性的IgG用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶进行酶解，则可得到特异性抗体的Fab片段。其中： 前者酶解产生二分子的Fab和一个完整的Fc段，后者酶解则产生一个F（ab′）2和Fc段的碎片。Fab的优点是分子量小，易渗透，而且也可进行标记，同时因无Fc段，可消除抗体与具有Fc受体的无关细胞的结合，从而大大减少假阳性。 ⑶基因工程抗体的特点和制备 基因工程抗体又称重组抗体，它是应用DNA重组技术和蛋白质工程技术制备的抗体，特点是：①无种系异源性，不会诱发宿主的免疫反应；②能直接制备人源性的抗体； ③不仅保持鼠源性单抗的特异性和亲和力等优点，而且其免疫作用更强；④应用范围加宽，使用途径增多，针对性更强，可广泛应用于免疫学研究和肿瘤的免疫基因治疗；⑤可作为建立“抗体库”的筛选试剂。 *“ 抗体库（antibodic bank）”是指通过将某种生物体的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，再利用不同的抗原与其反应，从而筛选出携带特异抗体基因的克隆，并由此而获得相应的高亲和力特异性抗体的一项基因工程技术。 第三节 补体系统 ⒈补体（complement）的概念 补体是一类存在于人和动物血清中具有酶活性、能与任何抗原抗体复合物发生结合反应的复合蛋白质。 ⒉补体的性质 补体由9个成分11种血清蛋白质组成，即C1┄C9及C1q、C1r和C1s。C1q可通过两种激活途径即经典激活途径和旁路激活途径，并按一定的补体激活顺序呈现连锁的酶促反应，最终成为一种化学介质或免疫效应物质参与机体的免疫病理过程。在免疫组化工作中，主要作为制备证明有无免疫复合物存在的桥连抗体示踪试剂。 第四节 核酸 ⒈核酸是组成一切生物细胞生命活性物质的基本成分，由多个核苷酸分子连接而成，为此，核酸又叫多聚核苷酸。核酸是由碱基、戊糖和磷酸三种成分组成的大分子化合物，可分二大类：去氧核糖核酸（DNA）及核糖核酸（RNA）。 ⒉DNA 主要以双股链存在于细胞核内，其基本成分为碱基（A、G、T、C）、去氧戊（核）糖及磷酸。DNA的分子结构有三级：一级结构为长核苷酸单链；二级结构为双股核苷酸链组成的双螺旋模型；三级结构为超螺旋结构。 DNA的复制和转录均是在其双股链解聚成单链后，按照碱基互补规律（A-G，T-C，G-A，C-T或U-C，C-U） 进行的。链间的氢键能量相对较低，体外高温即可解链，这是核酸杂交的理论基础。 ⒊核糖核酸（RNA） 主要存在于细胞浆内，以单链的形式存在，由碱基（A、G、U、C）、戊糖和磷酸分子所组成，依其功能可分为四类：转运核糖核酸（tRNA）、信使核糖核酸（mRNA）、核蛋白体核糖核酸（rRNA）和小核核糖核酸（snRNA）。 ①tRNA 在细胞内含量居中，分子量较小，半衰期24h以上，细胞含量居中，是遗传信息翻译成蛋白质合成语言（氨基酸）的执行者，主要通过其反密码子与mRNA的相应密码