相分离技术分离纯化膜蛋白-翻译.docVIP

相分离技术分离纯化膜蛋白 摘 要 相分离是用来纯化和浓缩洗涤剂溶膜蛋白的一种简单、高效且廉价的方法。尽管如此，在膜蛋白科学中相分离并没有被广泛使用，并且只有相对较少的去污剂/膜蛋白的结合体具有随时可以使用的实验方案。在这里，我们总结了影响用于膜蛋白研究的常见去污剂的相分离行为的理化参数。并列举出了用这种方法以不同种类的去污剂纯化膜蛋白的成功例子。在许多下游应用（如膜蛋白结晶或功能分析）中，去污剂的选择是至关重要的，我们讨论了对于一个给定的去污剂缓冲系统如何来给出新的相分离实验方案。引 言 去污剂用来从生物膜中提取膜蛋白和调整它们在水溶液中的溶解度，这是进一步进行蛋白质纯化的先决条件[1]。膜蛋白的纯化一般来说较为繁琐[2]，因为把它们从自身的膜环境移入到去污剂缓冲区，只能部分地模拟类脂膜的理化性质。因此，提取后许多膜蛋白不能保留其生物活性，或者只能部分地或者只能在非常特殊的缓冲溶液中保留活性。 提取后，可用用于可溶性蛋白质的相同的层析法进行膜蛋白的纯化，其区别在于去污剂必须一直在缓冲区。去污剂不会干扰离子交换或金属螯合色谱，只是有时候会干扰亲和层析法。尺寸排阻色谱法中，结合去污剂会增加膜蛋白的表观分子量。 相分离技术是一个功能强大的、可替代或补充色谱法的纯化实验方案。它可直接应用于溶膜，从可溶性蛋白质和其它亲水性杂质中分离出膜蛋白。这种粗纯化实验方案可用于膜蛋白组学或者作为色谱纯化的第一步[3,4]。另外，相分离可用于纯化后期的同时浓缩和和进一步纯化步骤[5]。 使用相分离的步骤来纯化膜蛋白有许多好处。该方法具有操作简单、不需要复杂的实验设备、易进行试验放大、可以和大多数色谱结合使用等优点。其中特别对于脱除亲水化合物是非常有效的。此外，膜蛋白可以同时纯化和浓缩，可与采用（NH4）2SO4或其它盐的可溶性蛋白的沉淀实验方案的效率相比拟。这种方法可能有的缺点是，高浓度的去污剂不利于蛋白的稳定以及会干扰生物化学试验和其结合过程。渗析或其他方法与去污剂吸收或凝胶过滤一样，可能需要从溶液中除去多余的去污剂。 本文中，我们描述了影响用于膜蛋白纯化的不同类别去污剂的相分离的理化参数。并论述了成功的相分离技术的实验方案，以及如何调整实验方案用于新的去污剂缓冲体系。 去污剂的一般性质 去污剂是两亲性分子，通常由一个极性或电荷头基和憎水烃链组成。在非常低的浓度下，这些分子可溶于水的单体。当增大去污剂浓度超过所谓的临界胶束浓度（CMC），去污剂分子聚集形成一个非常窄尺寸分布，称为胶束。胶束的大小取决于去污剂的类型；去污剂常用于膜生物化学，胆酸钠的聚集数（如，去污剂分子每胶束）的变化幅度为2到3，Triton? X-100的聚集数约为140。此外，胶束的大小和临界胶束浓度（CMC）取决于离子强度和去污剂溶液的温度。虽然离子去污剂的临界胶束浓度（CMC）随盐浓度的增加而降低，但受温度影响较小，非离子去污剂的临界胶束浓度（CMC）不受盐的影响，但随温度的上升而增长[7]。其它影响胶束的大小和临界胶束浓度的因素是压力，pH值，以及杂质的存在[6]。 浊点和相分离 通过提高去污剂浓度，或者通过改变温度，又或者改变胶束去污剂水溶液的盐浓度来达到所谓的浊点。胶束溶液会变混浊；胶束不能与水混合并形成较大的聚集体，从而区分于水相。大多数但并非所有的去污剂都可分成富去污剂相，而反过来其仍然包含了大量的水。依靠去污剂和缓冲体系，富去污剂相可以完全清澈或混浊并可以建立在贫去污剂相上方或下方。这一过程被称为相分离，或者有时称为浊点萃取。相分离是由于单相和两相体系的熵的差异产生，同时也具备温度依赖性。结果类似于蛋白质沉淀因使用聚乙二醇（PEG）或（NH4）2SO4而没有足够的自由水可保持蛋白质充分水化，从而得到溶解。同样，少量的水覆盖去污剂胶束聚集体的表面从而形成一个独立相，这种聚集体行为受温度，盐，和聚合物的影响。 相 图 图1显示两个去污剂相水溶液简单的例子，展示了去污剂随温度和浓度增长的两个不同的相形态。所有的去污剂都是低浓度的单体溶液。单体去污 图1. （A）简化的下会溶边界的去污剂相图。这种类型的去污剂通常 是非离子的。所有聚乙二醇（PEG）为基础的去污剂都是这一类。（B） 简化的上会溶边界的去污剂相图。这是经常可以观察到的两性离子去污 剂和糖苷去污剂。 剂溶液与胶束溶液由CMC分开并依赖于其本身的温度。高于此浓度，则去污剂由胶束构成一个特定的大小。胶束溶液和相分离之间的界线在相图中叫做上限或下限会溶边界。在图1A中，去污剂的浊点增长达到中间体浓度的胶束溶液的温度，就达到了混溶边界。而在图1B中去污剂的浊点降低达到中间体浓度的去污剂胶束溶液的温度，就达到了上混溶界限。图1A中是是典型的PEG—去污剂的相形态，而在图1B中的上混溶界限可观察到许多两性离子和糖