圆二色仪教学课件.ppt

（一）蛋白质结构分析的前提条件 1、蛋白质分析鉴定的重要性 2、样品的纯度要求 3、样品的浓度要求 4、参照液的参数 1、蛋白质分析鉴定的重要性 关于基因工程产品纯度和生物活性的评价，对于临床应用极为重要。根据FDA（美国食品药物管理局），USP（美国药典质量）和国际药检标准，基因工程产品的纯度要求必须大于97％（国内目前规定95％以上）。药品的质量标准不可任意降低，任何不纯和污染都会带来健康上的问题。 2、 样品的纯度要求： HPLC层析，主峰面积 95％ SDS电泳后，银染色一条带， 扫描主峰 95％ 基因工程产品的比活性符合国际标准。 3、样品浓度要求： 蛋白浓度：远紫外区：15?30 ug/ml 近紫外区：150～300ug/ml 用 量：800ul 检测方法：紫外吸收法、 考马斯亮兰G 250等。 常用检测仪器：紫外分光光度计。 4、不同的溶剂和它们的短波波长限制（一） 使用的波长限制 溶剂 1cm cell 1mm cell 0.1mm cell 甲醇 ?210 ?195 ? 185 极性 乙醇 ?210 ?195 ? 185 极性 三氟醋酸 ?264 ? 252 ?245 四氯化碳 ?250 ? 240 ? 230 非极性 氯仿 ?240 ? 230 ? 220 介于中间 己烷 ?210 ?185 ? 180 非极性 使用的波长限制 溶剂 1cm cell 1mm cell 0.1mm Distilled Water ~185 ~180 ~175 10mM Sodium phosphate ~182 0.1M Sodium phosphate ~190 0.1M Sodium chloride ~195 0.1M Tris-HCL ~200 0.1M Ammonium citrate ~220 不同的溶剂和它们的短波波长限制（二） （二）使用CD仪的注意事项 1.样品的浓度：根据样品性质、测量的波长范围决定。 远紫外： 200 微克/ml 左右；近紫外浓度增加10倍 2. 缓冲体系:对测定结果的影响。如果有需要辅助离子时尽 量不用NaCl，Na离子噪音大。 蛋白样品常用介质：H2O; 10mM PBS; 0.5mM-5mMTris-HCl 3. 比色皿的清洗处理：测试完毕，洗净后浸泡在乙醇中。 4.实验环境：室内恒温，空气净化，保持清洁，废纸、 废液要及时清理。 仪器使用预约联系： 许云敏 发表文章一 J.of Protein Chemistry,Vol.18,No.5,1999 Methanol-Induced Unfolding and Refolding of Cutochrome b5 and Its P40V Mutant Monitored by UV-Visible,CD,and Fluorescence Spectra 应用紫外，CD，荧光光谱分析甲醇诱导的细胞 色素b5及其突变体P40V的去折叠和重新折叠现象