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利用基因芯片分析拟南芥中参与蜡质生物合成的候选基因 摘要：植物表皮蜡质组成疏水层覆盖于植物器官的表面，构成一层屏障以抵抗不受控制下的的水分流失和生物胁迫。蜡质的生物合成需要大量酶的协同作用，主要参与长链饱和脂肪酸形成及转化成几种脂肪族复合物的过程。我们发现数据库中有282个候选基因可能在蜡质的合成，调节和运输中发挥作用。为了鉴定最有意义的候选基因，我们通过实施基因芯片试验来测定15d苗龄的拟南芥（地上部分）的204个基因的表达水平。发现样本中仅仅有25%的假定候选基因表达水平显著，所以基因数量的显著降低将值得利用反向遗传学的方法来表明它们参与蜡质的积累。我们鉴定出一个β-酮酰基CoA合成基因At5g43760，它在大部分的组织和器官中受蜡质基因CER6的共同调节。通过比较我们表明在15d苗龄的叶片和茎秆中脂酰CoA还原酶和蜡质合成酶基因不表达，引发的问题就是关于参与乙酰还原途径的酶大约占据总蜡质的20%。 引言 水是植物生存的必要条件。贯穿于植物生理，结构和形态适应的进化过程中，植物需要在恶劣的环境条件下为了生存而保持最佳的水分状态。事实上，众所周知早期陆生植物的古生物化石中就出现了发达表皮和气孔特殊结构[1,2]。这两种结构是植物在光合作用气体交换下控制水分流失到干燥的大气中所必须的[3,4]。 植物生长在一个暴露的环境中应该形成一种机制来抵御非控制下的水分流失。这种机制应该是有效的，光合辐射透明，灵活和自我愈合的。植物的角质层控制着表皮外侧细胞壁和植物临近大气层之间水分的流动，并具有以下特征：它的膜比较薄（0.02-10um厚度），该膜为一多糖聚合物（角质）和相关的溶剂可溶性脂类（蜡质）[5]。角质大多数是由C16和C18羟基脂肪酸通过酯键形成的三维聚合物[6-10]。 角质层的蜡质是一种由长链脂肪族化合物组成的复合物质结构，同时也含有萜类和次级代谢产物，如固醇类和黄酮类。角质层蜡质的物理和化学特性决定植物的主要功能。事实上，蜡质除了在保护植物的暴露部分免受非控制下水分的流失作用以外[3,4]，它还具有防止紫外辐射，减少灰尘、花粉和空气污染物沉积的作用[11]。除此之外，还能够确信植物表面的蜡质在抵御细菌和病原菌感染上发挥重要作用[12]，同时还参与植物和昆虫的互作。 含有20-32个碳原子的饱和长链脂肪酸的形成需要大量酶的参与[13]，它们进一步的转化成集中脂肪族复合物形成了蜡质层（图1）。两种主要的蜡质生物合成途径共存于植物的表皮细胞：一种是酰基还原途径，主要产生伯醇和蜡酯，另一个是脱羰基途径，主要形成醛类，烷类，仲醇和酮类[14]。 在不同种类的植物中已经分离出几个蜡质突变体[11,14-16]。拟南芥中的突变体loci被命名为eceriferum（cer），在这个模式植物中已经鉴定出了22个独立的cer位点。突变体显示出蜡质组成不规则或蜡质成分的整体减少[17-20]。 过去几年中，五个CER基因已经被克隆出来（CER1,2,3,5和6），但是仅仅CER5和CER6相对应的蛋白质生物功能是确定的，他们分别编码ABC转运蛋白和一种延长酶复合物的缩合酶[11,12]。 进一步的利用拟南芥cer突变体，将更多的编码参与蜡质生物合成的蛋白质基因进行克隆和分析。一个位于玉米中的GLOSSY8突变体（GL8）导致长于C24蜡质复合物水平的降低。后期显示出相对应的基因编码一种还原酶，其参与VLCFAs的合成[22,23]。蜡合成酶（脂酰基CoA:脂肪醇酰基转移酶），催化线性脂合成的最后一步，它是从发育的荷荷巴胚胎中被分离和纯化的。并进行了相对应基因的克隆[24]。近年来，WINI/SHINEI被进行说明，它是一个Arabidopsis thaliana乙烯响应类型的转录因子，其过量表达能够上调叶片和茎秆中蜡质的产生[25,26]。 我们目前的认识所以被局限在不同植物种类的有限的基因数量上，几种方案已经被研究来探索蜡质生物合成的其它途径。这些方案中一部分主要依赖于对候选基因库的鉴定，这些候选基因在蜡质的合成，调节和运输上发挥作用，一旦预测了它们的功能，那么它们的同系物和表达类型也会被知晓。在最近的研究报道中，Kunst and Samuels [11]建立了35个基因列表，其编码蜡质生物合成酶。我们利用他们的列表作为起点，经公开的数据库检测后增加到了147个候选基因（TIGR，TAIR，Arabidopsis膜蛋白库， Arabidopsis脂蛋白基因库）。而且，近来发现ABC转运蛋白在蜡质沉积中发挥作用[21]，我们添加了135个编码ABC蛋白的基因于列表中，使基因总数达到了282个。 在已经鉴定出来的282个候选基因中，我们在15d拟南芥地上部分植物中研究了204个基因的表达：18个β-酮酰CoA合成酶（K