核酸的分离与纯化27052.pptVIP

核酸的分离与纯化 基本知识回顾 核酸(nucleic acid)：以核苷酸为基本组成单位 的生物信息大分子 具有复杂的结构 DNA 重要的功能 天然存在的核酸 信息的载体 RNA 信息的储存、传递与表达 基本知识回顾 DNP-脱氧核糖核蛋白 RNP-核糖核蛋白 真核生物-染色体DNA和细胞器DNA 原核生物-双链环装质粒DNA 基本知识回顾 第一节 核酸分离与纯化的设计与原则 DNA 组成： 染色体DNA、细胞器DNA、质粒DNA。 分子总长随生物进化程度而增长 RNA 分子比DNA分子要小的多。 功能多样性 种类、大小、结构都具多样性 一、材料与方法的选择 材料与方法的选择 临床标本繁多：血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 不同的研究目的对核酸的完整性、产量、纯度和浓度可能有不同的要求，还需考虑制备核酸所需的时间与成本，在不影响核酸质量的情况下，应选择完全无毒的试剂与方案。 选择原则 一是保证核酸一级结构的完整性 二是尽量排队其它分子的污染，保证样品的纯度。 保持核酸的完整性 首先，应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏（pH，高温） 其次，对无法避免的有害因素，应采取多种措施，尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏（提取时间、DNA酶、RNA酶等）。 二、技术路线的设计 核酸的释放 DNA与RNA均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是破碎细胞、释放核酸。 机械法 液体剪切法 细胞的破碎方法 固体剪切法 非机械法 干燥法 溶胞法 二、技术路线的设计 续 核酸的分离与纯化： 利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异设计有效方案，才能使核酸得以分离。 细胞定位与组织分布上的差异 核酸与其它物质的差异： 物理化学性质上的不同 各自独特的生物学特性 二、技术路线的设计 续 核酸的浓缩、沉淀与洗涤 核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物过程中核酸分子不可避免的丢 失，样品中核酸的浓度会下降 三、鉴定与保存 核酸的鉴定 1.浓度鉴定：可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。 紫外分光光度法： 原理：核酸分子成分中的碱基具有一定的紫外线吸收特性。核酸的最大吸收波长为260nm，溶液中核酸的浓度与溶液在260nm紫外线下的吸光度（修正参数：A260－A310）成正比。 灵敏度：0.25ug/ml 荧光光度法： 原理：核酸的荧光染料溴化乙锭（EB）嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线激发下发出检红色的荧光，且荧光强度积分与核酸含量呈正比。 灵敏度：1-5ng 三、鉴定与保存 2.纯度鉴定： 紫外分光光度法 DNA：在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280比值为1.8 蛋白质（280nm）与酚（270nm）使比值下降 RNA（260nm）使比值升高 RNA：在TE缓冲液中，纯RNA的A260/A280比值为2.0，但由于RNA二级 结构不同，其读数可能在1.8-2.1之间波动。 鉴定RNA纯度所用溶液的pH会影响A260/A280读数。 三、鉴定与保存 2.纯度鉴定： 荧光光度法 用EB示踪，进行核酸电泳： DNA分子电泳迁移率低； 总RNA（三条带）： 23S rRNA 28S rR