分子生物学实验讲义.ppt

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实验成绩(100分) 实验技能 40分 实验报告 20分 实验态度和实验习惯等 20分 设计报告 10分 实验总结及体会 10分 日 常 要 求 上课时间:上午8:00-下午5:00, 提前5分钟进入实验室; 请假须医院病假条或班主任签字的假条; 上课时需穿实验服,不许在实验室内吃东西; 实验课期间不许打闹、闲聊等,保持课堂纪律; 随时保持实验台的整洁; 认真作好值日工作,离开实验室须向教师声明; 必须做到课前认真预习,课间做好实验记录、课后详细总结实验结果并按时提交实验报告; 作 业 预习实验教材第一部分:基因的克隆与表达 写出实验思路 电 子 天 平 天 平 pH 计 精确的pH值测定 移 液 器 液体试剂的精确取量 灭菌器 洗涤实验用的玻璃器皿 配试剂 1. 0.5 mol/L EDTA 100mL/实验班 160mL水中加所需的EDTA-Na2,用NaOH调 pH 8.0 (约需4g NaOH),后定容至200mL。 2. 75%乙醇 500mL/实验班( 95%乙醇配制 ),分成四 份。 3. 50xTAE 400mL/实验班,分成四份。 4. TE 100mL/实验班,分成四份。 PCR基因扩增及扩增产物的回收 实 验 流 程 反应体系 ddH2O 35.7uL 2.5mmol/L dNTP 4uL 10xbuffer 5uL 引物 (10umol/L) 4uL 模板DNA 1uL Ex-Taq E 0.3uL(1.5U) PCR产物的回收(博大PCR产物快速胶回收试剂盒) 1. 切胶、称胶重,每100mg胶加入700uL溶胶液,550C溶胶(一定要完全溶解)。 2. 装柱,12000rpm离心30秒,去除废液。 3. 漂洗:500uL漂洗液,12000rpm,30秒漂洗一次,去除废液,重复漂洗一次。 4. 12000rpm,2分钟,换成干净的无菌1.5mL小管。 5. 向柱子的正中央加20uL洗脱buffer或无菌水,放置5分钟。 6. 12000rpm,30秒。 7.向柱子的正中央加10uL洗脱buffer或无菌水,放置5分钟。 8. 12000rpm,2分钟。 9. SYBR检测回收产物 配试剂 1. LB液体培养基 40mL/组 胰蛋白胨(tryptone) 0.4g 酵母提取物(yeast extract) 0.2g NaCl 0.4g 加入40mL水溶解后加8μL 5mol/L NaOH,混匀, 分装到大试管(4mL/管)中, 灭菌后40C 保存。 2. 0.5 mol/L EDTA 100mL/实验班 80mL水中加所需的EDTA-Na2,用NaOH调 pH 8.0(约需2g NaOH),后定容至100mL, 40C 保存。 3. 50xTAE 400mL/实验班,分成三份,40C 保存。 质粒DNA的提取及其定性定量分析 实 验 流 程 DNA 重 组-酶切和连接 感受态细胞的制备 1. 预培养:接NovaBlue单菌落到含12.5ug/mL Tet的3mL LB培养基中,370C、190rpm振荡培养过夜 2. 取 0.4mL预培养菌液转移到含12.5ug/mL Tet 的40mL LB液体培养基的锥形瓶中, 370C、250rpm振荡培养2.5-3小时(OD600 0.4-0.5) 3. 将菌液转移到50mL离心管中,冰上放置10min 4. 40C, 4000rpm ,离心10min 5. 到出培养液,将管倒置使培养液流尽 6. 菌体加入预冷的0.1 mol/L的CaCl2 10mL,用5 mL枪头轻轻吹散菌体细胞,冰浴30min 重 组 质 粒 转 化 表 达 菌 株 详见前面的实验。 感受态细胞200uL,加入0.5uL阳性重组质粒 感受态细胞200uL,加入0.5uL空质粒(未插入外源基因)--对照表达菌株 感受态细胞200uL,加入2uL pETBlue-2 感受态细胞200uL,加入2uL无菌双蒸水(阴性对照) 0.1mol/LCaCl2溶液200uL,加入2uL阳性重组质粒(阴性对照) 基因组DNA的分离 碱性磷酸酶的原核表达 1.预培养:分别接一含pETBlue-2-AKP表达质粒和pETBlue-

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