北师大版高中生物选修1生物技术实践聚合酶链式反应技术.pptVIP

2.DNA自动化测序 方法要点 ● 基于Sanger法的基本原理 ● 用标记荧光染料的ddNTP ● 经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 ● 用荧光检测仪检测信号经计算机分析 ● 得到DNA分子序列 DNA自动测序结果举例 PCR METHODS STANDARD PCR HOT START PCR RT PCR IN SITU PCR PCR-ELISA REAL TIME QUANTITATIVE PCR HOT START PCR In ‘hot-start’ PCR , at least one reaction component, which can include the polymerase, salt (KCl or MgCl2) or dNTP(s), is withheld from the reaction until the system reaches a particular temperature. RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 1. RNA preparation 2. Reverse transcription 3. PCR 4. Result Analysis:Quantification or cDNA clone Semi-Quantify RT-PCR 1. RNA preparation 2. Reverse transcription 3. PCR: a. Target Gene Specified primer b. GAPDH or β-action primer 4. Quantification Target Gene GAPDH or β-actin 在相对定量检测中，为了比较不同样本mRNA 表达量水平，要求不同的样本之间起始细胞数目相同， RNA 提取效率相同，且目的基因的扩增效率相同，——不可能同时满足。 为了避免不同标本在RNA 的产量、质量及逆转录效率上可能存在的差别，获得目标基因特异性表达的真正差异——选择一定的内参基因进行校正和标准化。 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 　根据实验，选择内参基因 REAL TIME QUANTITATIVE PCR ??????????????????????????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 原理： 根据荧光染料形成 特异性荧光信号的 强度，计算出模板 DNA或mRNA的含量 用途：???定量分析mRNA或DNA 优点： 可进行自动化定量 分析、降低假阳性 实时PCR的基本过程 基因克隆 医学检测 (基因诊断) WHAT CAN PCR DO FOR US? 一、基因克隆: PCR 应用 PCR Product digest mix DNA ligase plasmid ? ? Gene cloning : PCR product + vector? PCR法 设计引物 分段PCR 基因改造 再次PCR 获得突变基因 (一) 基因突变的检测 1、基因缺失或插入 基因检测 2、点突变 位于酶切位点上的点突变：限制性酶切片段分析法 不在酶切位点上的点突变：单链构象多态性分析法(PCR-SSCP) 致病基因上的未知点突变： PCR-SSCP （单核苷酸多态性，SNP） PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)限制性 片段长度多态性 1. 分析已知突变 。 2. 突变碱基涉及酶切位点的变化。 PCR 酶切 电泳 PCR-RFLP 5’ CCACGG 3’ 3’ GGTGCC 5’ * 5’ CCATGG 3’ 3’ GGTACC 5’ * Resistance to NcoI Digestion Susceptible to NcoI Digestion Homozygous Mutant Homozygous Wild-type Heterozygote Di