质体色素研究报告.doc

PAGE PAGE 3 烟草及烟草制品 质体色素的测定 高效液相色谱法 研究报告 1. 概述 烟草所含的色素可依据不同的颜色、性质和对烟草品质的影响，分为三大类：绿色素、黄色素和黑色素。绿色素主要是叶绿素（Chlorophyll）；黄色素主要是胡萝卜素（Carotene）和叶黄素（Lutein），统称类胡萝卜素；黑色素主要是多酚的酶促棕色化反应和非酶棕色化反应（Maillard反应）产生的醌类和杂环类混合物。通常所说的烟叶质体色素，存在于烟叶植物细胞中细胞器的质体中（其中的叶绿体和有色体），主要包括新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b、β－胡萝卜素等。有研究表明，类胡萝卜素是烤烟致香成分的重要前体，在烟叶中性香味成分中，有很大一批化合物是类胡萝卜素的降解产物，如巨豆三烯酮、氧化异佛尔酮、β-大马酮、β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯等都是烟草中特别重要的香味物质．调制后烟叶中的类胡萝卜素主要是β-胡萝卜素和叶黄素，叶黄素是胡萝卜素的含氧衍生物。烟叶在调制、加工与陈化过程中色素降解完全和得当，会使烟叶香气增加，色泽鲜亮，提高烟叶的品质和可用性。因此研究烟叶中质体色素的测定方法对烟草制品的生产和品质提升具有重要的实际意义。 我国目前还没有烟草中质体色素的分析方法标准。项目组查阅收集资料，考察了目前国内的分析状况。烟草质体色素的萃取通常用含丙酮的溶剂。赵世杰等研究不同萃取方法对测定结果的影响：方法一为80％丙酮萃取后定容，加水后用乙醚萃取；方法二为用水浸泡萃取后，残渣用80％丙酮萃取。结果表明，鲜烟叶可直接用80%丙酮萃取测定；调制后的烟叶经水浸提后，再用80%丙酮萃取其中的叶绿体色素（或用80%丙酮萃取全部色素，再用乙醚萃取色素）进行测定。邱玲、时亮等在测定烟叶β-胡萝卜素时用90%丙酮与烟叶样品一起研磨，减压过滤并冲洗数次，加水后用苯萃取。杜咏梅等在90%的丙酮溶液浸提鲜烟叶色素的基础上，用氢氧化钾的甲醇溶液将叶绿素及叶黄素的酯皂化，形成溶于水的盐，再用乙醚萃取类胡萝卜素。刘国顺等则用加过0.1%BHT的丙酮溶液进行研磨萃取，然后加入0.1g醋酸铅，于4℃下以10000r/min离心5min以除去蛋白质。最近研究较多的方法是用90%丙酮振荡萃取后，取部分萃取液稀释后过Sep-Park-C18固相萃取小柱预分离和富集烟草色素（小柱先用15ml甲醇活化，再用30ml水洗去小柱上残留的甲醇） 经典的植物色素测定方法是分光光度法，早先测定烟草色素基本采用该法。分光光度法一般是用波长扫描、经验公式计算得到烟草中各种质体色素的含量，或在445nm下测定总类胡萝卜素含量。此法操作步骤繁琐、耗时、试剂消耗大,结果重现性差。邱玲等使用薄层色谱扫描法测定β-胡萝卜素。通过文献调研我们发现，高效液相色谱法分离分析烟草色素是近年来使用较多的方法。目前使用最多的测定烟草中质体色素的方法是流动相采用1：1的甲醇和异丙醇与水梯度洗脱，而分析检测的质体色素大多是其中含量较高的如β-胡萝卜素和叶黄素等。 国外方面，AOAC的食品营养委员会在脂溶性维生素测定方法中推荐了采用反相HPLC测定副食及食品原材料中的β-胡萝卜素。该方法采用二氯甲烷和乙醇提取目标物，然后在C18柱上分离β-胡萝卜素的各种立体异构体（全反式、9－顺式、13－顺式、15顺式）并在448nm波长处检测。如果样品中有相对较高含量的顺式α-胡萝卜素，则有可能会产生干扰，因此采用强选择性、柱长更长的C30反相液相色谱体系来避免干扰并在445nm处检测。Tsao, R等采用高速反流色谱萃取纯化万寿菊、南瓜和土豆中的叶黄素、紫黄质和β-胡萝卜素，样品经己烷萃取4次后，40℃下避光真空浓缩，浓缩物溶解在异丙醇中，然后用N2保护下用15％的KOH皂化，皂化溶液用乙酸乙酯萃取然后用HPLC分析。Larsen 等采用丙酮萃取绿色蔬菜中的类胡萝卜素，使用强碱性树脂皂化选择性除去叶绿素和酯化的脂肪酸后进行分析，该方法对紫黄质、叶黄素和β-胡萝卜素的回收率在99％－104％，对新黄质的回收率为119％。Nonier M.F.等加入MgSO4中和样品中的游离酸（可能导致类胡萝卜素的异构化反应），及BHT、BHA抗氧化剂，采用丙酮萃取、萃取液经皂化（除酯及多酚），然后用乙醚萃取后HPLC分析，在450nm处检测。 综上可以看出，目前对质体色素的提取基本都采用皂化步骤，该步骤虽然可以除去酯类物质的干扰，但该步骤繁琐、费时、消耗大量的溶剂，并且采用该前处理方法不能同时测定其中的叶绿素。根据文献，项目组对分离条件进行了初步的试验，发现使用传统的甲醇－异丙醇－水体系梯度洗脱时，新黄质和紫黄质分离不好，分离度不高。由于这两种色素的含量较低，采用该方法对这两种质体色素进行定量显然不够准确。 因此，项目组拟在前期文献调研的基础