IPTGyou导蛋白表达的原理.docVIP

IPTG诱导蛋白表达的原理 IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。 用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将 基因表达启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达. IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。 但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。 最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵 子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.???? 这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表 达系统载体构建的常用元件。tac启动子是 trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。trc启动 子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。在常规的 大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付 多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下 较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的 lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。现在的Lac/Tac/trc载体 上通常还带有lacIq 基因，以表达更多 lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定 毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作 为诱导物的研究。另外一种研究方向是用 lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开发。热诱导不用添加外来的诱导 物，成本低，但是由于发酵过程中加热升 温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一 些蛋白酶会影响产物稳定.????? T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的 主流，这个功能强大兼专一性高的启动子 经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表 。强大的T7启动子完全专一受控于T7 RNA 聚合酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成 mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍— —当二者同时存在时，宿主本身基因的转 录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅 几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋 白的50%以上。由于大肠杆菌本身不含T7 RNA 聚合酶，需要将外源的T7 RNA 聚合酶 引入宿主菌，因而T7 RNA 聚合酶的调控模 式就决定了T7系统的调控模式——非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状 态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿 主细胞以及质粒稳定性的影响；通过控制 诱导条件控制T7 RNA 聚合酶的量，就可以 控制产物表达量，某些情况下可以提高产 物的可溶性部分。 有几种方案可用于调控T7 RNA 聚合酶的合成，从而调控T7表达系统.????1.噬菌体DE3是lambda噬菌体的衍生株，含有lacI抑制基因和位于lacUV5启动子下的 T7 RNA 聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如 BL21(DE3)就是最常用的表达菌株，构建好 的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导调控方式和lac一样都是IPTG诱导.???? 2.另一种策略是用不含T7 RNA聚合酶的宿 主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的 蛋白对宿主细胞的潜在毒性而造成的质粒不稳定。然后用λCE6噬菌体侵染宿主细胞 ——CE6是lambda噬菌体含温度敏感突变 (cI857ts)和pL/pR启动子控制T7 RNA 聚合 酶的衍生株，在热诱导条件下可以激活T7 RNA 聚合酶的合成.???? 此了噬菌体之外，还可以通过共转化 质粒提供T7 RNA 聚合酶。比如有人用受溶 氧浓度控制的启动子调控T7 RNA 聚合酶合成，据说这比较适合工业化发酵的条件控 制.???? 由于T7 RNA 聚合酶的调控方式仍有可 能有痕量的本底表达，控制基础表达的手 段之一是培养基外加葡萄糖，有助于控制本底表达水平。2.是采用带有T7lac 启动 子的载体——在紧邻T7 启动子的下游有一 段lacI操纵子序列编码表达lac 阻遏蛋白 (lacI)，lac 阻遏蛋白可以作用于宿主染 色体上T7 RNA 聚合酶前的lacUV5 启动子 并抑制其表达，也作用于载体T7 lac 启动 子，以阻断任何T7 RNA聚合酶导致的