【年会报告】-XXXX生物教育年会报告（基因工程与细胞工程）.ppt

2010年省生物教学学会年会报告 基因工程和细胞工程 福建师范大学生命科学学院 肖义军 基因工程的基本操作程序 基因文库(gene library)概念 又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，通过筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。 基因文库由外源DNA片段、载体和宿主细胞组成。 基因组文库(Genomic library) 将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。该文库以DNA片段的形式贮存着该生物全部基因组的信息，可用于分离目的基因和保存某种生物的全部基因。 cDNA文库 (cDNA library) 提取某生物组织或发育时期的总mRNA，经反转录产生的cDNA (complementary DNA，互补DNA)片段分别与克隆载体重组，储存于受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。 构建基因文库的基本程序 1)提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA； 2) DNA片段或cDNA片段与经特殊处理的载体连接形成重组DNA； 3)重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌； 4)阳性重组菌落或噬菌斑的筛选。 基因组文库的类型 根据所选用的载体可以分为： 质粒文库、噬菌体文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。 高等生物的基因组DNA十分复杂,单个基因在基因组或某个特定发育阶段或特定组织中所占比例很小。因此，要想从庞大的基因组中分离某个特定的未知基因非常困难，因此先把材料DNA分成若干易于处理的片段，然后确定目标序列在哪一片段，再进一步从该片段寻找目标序列，事情就变得容易了。 从基因文库中筛选目的基因 1.通过克隆序列筛选：核酸杂交和PCR 2.通过表达产物筛选：免疫学检测（抗原抗体反应） 探针 探针是一小段带标记的单链DNA或者RNA片段（大约是20到500bp）， 用于检测与其互补的核酸序列。 最初是使用带放射性的DNA探针，通过放射自显影来显示位置。后来又发明了免疫探针法，将探针核苷酸的侧链加以改造，探针杂交后，其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别，从而显示出位置。 核酸杂交（菌落原位杂交法） 直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合,再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有目的序列的菌落。 PCR法获取目的基因 已知基因： 设计合成一对引物，直接从基因组DNA中扩增该目的基因。 未知基因： 参照其他物种中该基因的两末端设计引物，从基因组DNA（或文库）中扩增该目的基因； 依照其他物种中该基因的保守区段序列设计引物，扩增出一段DNA，标记为探针，从基因组文库、cDNA文库中钓出该基因。 PCR法获取目的基因的前提是：要有足够制备合适引物的信息 PCR法获取目的基因优点 1.简便快速：在有足够引物信息的情况下，可直接从基因组DNA中克隆目的基因，大大减少了基因分离的工作量； 2.灵敏度高：可从极微量的模板扩增出目的片段； 3.对起始材料质量要求低：由于其灵敏度高和特异性强，极微量的材料或者混合的组织、部分已降解的DNA材料都可以作为起始材料； 化学合成制备目的基因 如果蛋白分子较小，可根据氨基酸序列推导出其基因序列，采用人工合成的方法制备目的基因。化学合成法通常主要用于制备探针和引物。 磷酸二酯法 亚磷酸三酯法 获取目的基因的方法 一般来说： 目的基因的获得通常采用PCR法；化学合成法由于合成的片段较短，一般用于引物和探针的合成；基因文库一般用于保存基因资源。 目的基因检测与鉴定 通常采用分子杂交的方法。 分子杂交：采用已知标记的核酸分子或蛋白质分子检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子。 根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交（DNA）、Northern 杂交（RNA）和 Western 杂交 （蛋白质）。 分子杂交的方法 通常是采用各种方法将核酸（蛋白质）分子固定在固相支持物上，然后用放射性元素等标记的探针（抗体）与被固定的分子杂交，经显影（显色）后显示出目的核酸（蛋白质）分子。 Southern杂交(检测目的基因是否插入到受体细胞基因组中） (1)提取 DNA，酶切，凝胶电泳分离各酶切片段，然后使DNA原位变性。 　　 (2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。 　　 (3)