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第五章 抗 体 制 药 抗体指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。它是机体免疫系统受抗原物质刺激后,B淋巴细胞被活化、增殖和分化为浆细胞,由浆细胞合成和分泌的球蛋白。 病人血清中具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白,称为免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)。 Ig是化学结构的概念,而抗体是生物学功能的概念,所有抗体是Ig,但并非所有Ig分子都有抗体活性。 由于病原微生物是含有多种抗原决定族的抗原物质,因此制的这些抗体制剂也是多种抗体的混合物,故称为多克隆抗体。易出现非特异性交叉反应。 1975年K?hler and Milstein等首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出 McAb. 在临床上主要用于诊断和治疗。 第二节 单克隆抗体(Monoclonal Antibody) 3、筛选阳性克隆与克隆化 常用的检测方法:免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术 常用的克隆化方法:有限稀释法和软琼脂法。 有限稀释法:把杂交瘤细胞悬液稀释后,加入到96孔板,使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用HT培养液,以后的克隆化可用不含HT的RPMI 1640培养液。 软琼脂法:在培养液中加入0.5%的琼脂糖凝胶,细胞分裂后形成小球样团块,由于培养基是半固体状态,可用吸管吸出,移入96孔板培养。 5、单克隆抗体的大量制备 (1)体外培养法:可获得10μg/ml的抗体。多采用RPMI 1640培养液,添加10%--20%胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有血清成分,总蛋白量可达100 μg/ml以上,给纯化带来困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因,而且批间质量差异太大,直接影响杂交瘤细胞的生长。 改良的方法有:无血清培养法、悬浮培养法、微载体悬浮培养法。 无血清培养法:利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染,但产量不高。 悬浮培养法:连续悬浮培养的细胞密度可达2×107/ml, 收集的单克隆抗体可达400 μg/ml。如在培养液中加入微载体,细胞密度可达108/ml。 6、单克隆抗体的纯化 根据Ig的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法。 体外诊断试剂IgG类沉淀处理+亲和层析 IgM类沉淀处理+凝胶过滤 体内诊断试剂或治疗用药亲和层析+阴离子交换层析,注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。 (2)分离 A、凝胶过滤:用于IgG和IgM类。常用SephadexG 200 作为分离介质,可收集到3个峰,最高峰为IgM,另外两个峰为 IgG。抗体回收率达50~80%,能去除污染的微量杂蛋白,抗体纯度可达95%以上。 B、阴离子交换层析:用于IgG类的分离纯化。在pH7.4条件下,IgG1和IgG2能结合在DEAE填料上,其中IgG2a可在较低离子强度下洗脱下来,其纯度很高。 IgG2b和IgG3在低离子强度下易发生沉淀,可增加离子强度以提高产量,但其纯度相对较低。 C、亲和层析:多用蛋白A亲和层析。适用于IgG类。IgG类与蛋白A的结合与pH 有密切的关系。鼠源性单抗在 pH8.0时,IgG2b、IgG3几乎全部结合在蛋白 A柱上, IgG1稍差,用 pH3.5缓冲液可洗脱下 IgG2b,pH4.0缓冲液可洗脱下 IgG3,pH4.5缓冲液可洗脱下IgG2a, pH6.0可洗脱下IgG1。用蛋白A亲和层析收获的抗体纯度和很高,但也有极微量的杂蛋白。 二、鼠源性单克隆抗体的改造 目的:一是降低免疫源性;二是降低相对分子量,增加组织通透性。 原理:抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的可变区(V),同种性免疫源性则决定于抗体分子的稳定区(C)。 第三节 基因工程抗体和抗体工程 抗体研究的三个阶段: ①以1890年Behring发现白喉抗毒素为代表,其特点是用抗原免疫动物来获得多克隆抗体; ②以1975年K?hler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体为代表; ③以1994年Winter 以基因工程方法制备抗体为代表。它是抗体研究领域的一次技术革命,它不用人工免疫动物和细胞融合技术,完全用基因工程技术制备人源性抗体,而且还能利用基因转移和表达技术,通过细菌发酵或转基因动物或转基因植物大规模生产抗体。在此基础上发展成抗体工程。他创建了噬菌体抗体库(Repertoire of antibodies displayed on phages)技术,克服了人体不能随意免疫的缺点,用人外
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