PCR的原理和操作过程.pptVIP

PCR循环参数 94 ℃，3min；94 ℃，45s；58 ℃，1min； 循环30次72 ℃，1min；72 ℃，10min；16 ℃保温 （热力学参数） 94 ℃，3min；94 ℃，45s；58 ℃，1min； 循环30次72 ℃，1min；72 ℃，10min；16 ℃保温 94 ℃预变性，3min使DNA双链完全打开 退火： 58℃，1min 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵敏性。 变性： 94 ℃变性，45s 使双链DNA解链为单链 延伸：72 ℃，1min 温度为Taq酶最适反应温度72 ℃ 时间由扩增片段的长度决定 1min扩增1KB 谢 谢！ 放映结束 感谢各位批评指导！ 让我们共同进步 * * * * * * * * PCR原理和基本操作过程 2015.12.5 临床146生化实验小组 第一节 PCR技术原理 聚合酶链式反应（polymerase chain reation,PCR)是一种DNA体外核酸扩增技术。该技术能在短时间内将极微量的目的基因或某DNA片段扩增至十万乃至百万倍，从极微量的标本中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。PCR技术具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。 PCR基本原理 PCR基本反应步骤 一、PCR的原理 PCR技术是一种在体外模拟DNA的复制过程的核酸扩增技术。其原理是根据DNA的半保留复制，以及DNA分子在体外不同的温度下双链和单链可相互转变的机制，在体外人为地控制反应系统的温度，使双链DNA变性，成为单链DNA；其次，单链DNA与人工引物链在退火过程中配对结合；最后，在DNA聚合酶的催化作用下，使引物沿单链模板延伸为双链DNA，实现DNA的扩增。PCR三个基本反应步骤构成，即变性、退火、引物延伸。 二、三个基本步骤 变性(denaturation)-高温下将模板DNA双链打开 退火(annealing)-引物在较低温度下以共价键结合到模板DNA互补部位 延伸(extension)-TaqDNA聚合酶作用下，不断向引物3’端添加DNTP，DNA链不断延伸 反应液中含有所有成分，以温度变化来控制反应阶段： 变性95度，退火55度，延伸72度。 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 子链延伸 DNA加倍 DNA变性 形成2条单链 模板DNA 95℃ 变 性 第一轮扩增 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 58℃ 引物1 引物2 DNA引物 退 火 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 延 伸 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 第1轮结束 95℃ 第2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50℃ Taq Taq Taq Taq 72℃ PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 PCR的特点 灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA PCR 的特点 第二节　PCR的实验步骤 标准的PCR反应体系 10X 扩增缓冲液： 5μl 模板DNA: 0.1~2μ