脐带间充质干细胞修复化疗所致卵巢颗粒细胞损伤的体外实验.docVIP

脐带间充质干细胞修复化疗所致卵巢颗粒细胞损伤的体外实验 中文摘要 研究目的: 1. 建立人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)体外分离、培养的方法,研究其 生物学特性和表型特征,用于本实验下一步研究及进一步用于组织工程、细胞和 分子生物学的研究。 2. 探讨人 UC-MSCs 对化疗药物盐酸氮芥诱导的卵巢颗粒细胞(GCs)凋亡 的影响及可能机制。 研究方法: 1. 在无菌条件下取足月健康胎儿脐带标本,用双酶消化法、组织块贴壁法 两种方法分离、纯化脐带间充质干细胞UC-MSCs,同时进行两种方法的对比。 分离的原代干细胞用含10%的胎牛血清的 DMEM/F12 培养基培养,消化传代后, 取 P4-P8 代的细胞做共培养修复用。 2. 采自中山大学附属第一医院生殖中心接受体外受精-胚胎移植 IVF-ET 的患者共60余例,年龄27~35岁,有排卵证据,基础状态生殖激素水平正常,均为 输卵管因素或男方因素不孕者。采用促性腺激素释放激素激动剂GnRH-a/基因 重组人卵泡刺激素 rFSH/人绝经期促性腺激素HMG/人绒毛膜促性腺激素 HCG超促排卵方案,定期监测卵泡发育。当优势卵泡直径17mm 时,肌内注射 10,000U HCG,于注射36 h后B超下经阴道穿刺卵泡采集卵母细胞,同时收集卵 泡液。分离出其内的卵巢颗粒细胞,待其贴壁加入不同浓度的化疗药物盐酸氮芥 (浓度分别为 0.5mg/l、2.5mg/l、5mg/l)致培养基中作用24h 后,检测凋亡后选 择昀适浓度,一组为待其损伤后与脐带间充质干细胞以不同比例共培养48h,另 一组为与脐带间充质干细胞共培养 6h 后加入化疗药物致损伤,化疗药物同样作 用24h,脐带间充质干细胞共培养72h,采用 Hoechst33342-PI 双染,检测凋亡率, DNA-ladder 检测凋亡片段产生,Western-blot 检测颗粒细胞凋亡相关蛋白 bcl-2 和 caspase-3 表达的变化。评价 UC-MSCs 在化疗所致卵巢颗粒细胞损伤中的修 复作用。 结果:1. 体外培养的 UC-MSCs 形态均一,呈长梭行旋窝状生长,培养的第三代 I 细胞97%以上表达 CD44,CD29,CD59,CD105,但不表达造血及内皮细胞相关抗原 CD28,CD31,CD34,CD45,亦不表达免疫排斥相关抗原 CD40, CD86, HLA-DR, 证实为间充质干细胞。 2. UC-MSCs 大部分处于静止期和 DNA合成前(G0/G1 期),只有少数处于 分裂期和 DNA合成期。 3. 盐酸氮芥浓度为 5mg/l 时,卵巢颗粒细胞的凋亡率增高,生长抑制程度 明显,在 DNA-ladder 上也可见明显的断裂条带,选用该浓度来诱导颗粒细胞凋 亡。 4. 与 UC-MSCs 体外共培养修复化疗后所致颗粒细胞损伤的效果不是十分 理想,但在预防化疗所致颗粒细胞损伤的效果较对照组差异有统计学意义,即在 与脐带间充质干细胞共培养 6h 后加入凋亡诱导剂,其凋亡率较实验对照组明显 降低(共培养组早期凋亡率为 22.43±0.45%,晚期凋亡率为 13.57±1.58%, 实验对照组早期凋亡率为25.23±1.07%,晚期凋亡率为29.57±2.74%) 。差异 有统计学意义(P值均为0.000)。 5. Western-blot 结果显示,共培养组颗粒细胞 bcl-2 表达水平较阴性对照组 增高,而 caspase-3表达则下调。 结论: 人UC-MSCs可以有效预防化疗所致卵巢颗粒细胞损伤,且能够上调bcl-2的 表达和下调caspase-3的表达从而抑制颗粒细胞的凋亡。 关键词:化学治疗; 颗粒细胞; 脐带间充质干细胞; 共培养; 凋亡II Abstract Objective: 1. This study was designed to set up the method of separating mesenchymal stem cells from umbilical cord, and the biological properties and phenotypic character- istics in vitro2. Simulation of the chemotherapy-induced granulosa cells damage, and then co- culture with UC-MSCs to study if UC-MSCs could repair the chemotherapy-ind- uced damage of ovariesMethods: 1. In ste