2新型鼠疫、天花疫苗及cpgodn佐剂的非临床安全性研究及免疫毒性评价方法研究参加中国毒理学会优秀青年科技奖评选活动.docVIP

PAGE 2 新型鼠疫、天花疫苗及CpG ODN佐剂的非临床安全性研究及免疫毒性评价方法研究 PAGE PAGE 1 参加中国毒理学会优秀青年科技奖评选活动 疫苗免疫毒性评价方法研究（摘要） 刘丽1，林志1，屈哲1，刘晓萌1，孙立1，王超1，姜华1，苗玉发1，杨艳伟1，齐香荣2，魏东3，王秀文1，汪巨峰1，李波3 *(1.中国食品药品检定研究院 国家药物安全评价监测中心，药物非临床安全评价研究北京市重点实验室，北京 100176；2中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京，102206；3.中国食品药品检定研究院，北京 100050) 通讯地址：北京亦庄开发区宏达中路甲8号 邮编：100176 Tel：0108312 * 责任作者，Email：libo@nifdc.org.cn 目的:免疫毒性是疫苗临床前安全性研究关注的重点，但目前对疫苗的免疫毒性评价仍处于探索阶段，国内外相关指导性文件中多为原则性的建议和概括性的理论指导，缺乏具体的评价方法和评价体系。另外，新型疫苗产品由于作用机制、组成成分及制备工艺的新颖性和复杂性，可能带来额外的安全性担忧，对现有疫苗安全性评价方法形成了很大挑战。本研究拟通过对三种不同类型新型疫苗/佐剂进行以免疫毒性为重点的非临床安全性评价，初步建立疫苗免疫毒性研究的评价方法和评价策略，并通过对不同类型疫苗评价结果的比较，为同类疫苗或佐剂的安全性研究提供参考。方法:（1）针对疫苗可能引起的免疫刺激、免疫抑制、超敏反应和自身免疫等免疫毒性作用，从组织器官水平（脾脏、胸腺、骨髓、注射局部引流和非引流淋巴结、局部淋巴组织的病理学检查）、细胞水平（不同亚型免疫细胞比例变化、血液白细胞计数）和分子水平（细胞因子检测和血清白蛋白、球蛋白、免疫球蛋白、补体检测）进行了评价方法研究，并对一种新型细菌疫苗（鼠疫亚单位疫苗）、一种基因重组病毒疫苗（复制缺陷型天坛株痘苗病毒天花疫苗，简称NTV疫苗）和一种新型佐剂（含CpG基序的单链寡聚脱氧核苷酸，CpG 684）进行了系统的免疫毒性研究。（2）对疫苗免疫毒性评价的重点指标建立新的检测方法并进行多种方法的比较，包括：1）应用固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT法）、流式细胞术细胞内染色法和流式微球技术（cytometric bead array, CBA）三种方法检测细胞因子，并进行方法学和适用性的比较。2）建立抗原特异性IgE的检测方法，将过敏相关临床症状观察、血清总IgE检测和抗原特异性IgE检测、豚鼠致敏实验结合起来进行疫苗整体或疫苗所含特异性抗原致敏性的评价，并摸索疫苗免疫后血清IgE的适宜检测时间点。3）同时应用免疫荧光法和ELISA法进行血清抗核抗体（ANA）检测，并进行方法学比较。结果:免疫毒性评价方法研究结果：（1）分别从组织器官水平、细胞水平和分子水平进行免疫刺激性/免疫抑制的评价，并进行超敏反应和自身免疫的评价，可较为全面、系统地进行疫苗的免疫毒性研究。（2）三种细胞因子检测方法的比较研究：ELISPOT法与细胞内染色流式法测定结果一致性较好，前者灵敏度更高，而细胞内染色流式法可以选择特定细胞进行细胞因子分泌检测，具有更好的分析细胞特异性，两种方法对检测时间点的要求不是很严格，易于在疫苗的重复给药毒性研究中结合进行。流式细胞术CBA法检测血清中细胞因子的效果欠佳，且不适于进行IFN-γ检测，应用受到一定限制。（3）将临床症状观察、总IgE检测、抗原特异性IgE检测和豚鼠致敏实验结合起来是进行疫苗整体或特异性抗原致敏性评价的较好方法，血清IgE检测应在可能引起过敏反应的再次免疫前进行。 鼠疫疫苗、NTV疫苗和CpG 684佐剂免疫毒性研究的主要发现：（1）具有较强细胞免疫作用的NTV疫苗和CpG 684均引起动物可逆性的脾脏重量增加，CpG 684引起轻度的脾脏白髓内细胞密集和扩张的组织病理学改变；而以体液免疫为主的鼠疫疫苗未对脾脏重量和病理形态学产生明显影响。三种疫苗/佐剂均未引起胸腺重量的变化、未对骨髓产生影响。NTV疫苗和CpG 684均引起给药动物腹股沟淋巴组织出现明显的炎症性反应。（2）NTV疫苗和鼠疫疫苗未对动物外周血CD4+、CD8+ T细胞的比例和二者比值产生明显影响；三种疫苗/佐剂引起外周血各类白细胞数量可逆性变化，无一致性规律，与各自免疫特点有关。（3）鼠疫疫苗仅引起较低水平的IFN-γ和IL-2分泌；NTV疫苗可诱导IFN-γ分泌显著增加；流式细胞术CBA法仅检测到CpG 684-乙肝疫苗免疫大鼠和食蟹猴血清中低水平的Th1/Th2型细胞因子。三种疫苗/佐剂对血清白蛋白、球蛋白和总蛋白水平的影响不同。（4）鼠疫疫苗和CpG 684未引起过敏反应，NTV疫