基因工程-第3章-核酸操作的基本技术.pptVIP

3.1 碱抽提法提取DNA 碱变性抽提法又称碱抽提法或碱裂解法，是一种用的最广泛的制备质粒DNA的方法，是当今分子生物学研究中的常规方法。碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值达到12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8 的NaAc高盐缓冲液调节其Ph至中性时，变性的质粒ＤＮＡ又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体ＤＮＡ不能复性 而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体ＤＮＡ与不稳定的大分子ＲＮＡ、蛋白质－ＳＤＳ复合物等一起沉淀下来而被除去。 碱变性抽提质粒ＤＮＡ，除了菌体培养、质粒扩增和收集菌体外，其提取过程大体分为三个步骤：（１）从染色体ＤＮＡ中分离质粒ＤＮＡ。（２）去除质粒ＤＮＡ中的ＲＮＡ。（３）进一步纯化质粒ＤＮＡ，去除蛋白质等杂质。 3.1.1 碱抽提法所用各类试剂的生化作用 （１）溶菌液中的溶菌酶是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的Ｂ－１，４糖苷键，因而具有溶菌作用。 （２）NaOH-SDS液：核酸在pH５.９的溶液中是稳定的，但当pH１２ 或pH３时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。ＳＤＳ是离子型表面活性剂，它可以溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚 细胞